Novel role of estrogen receptor-α on regulating chondrocyte phenotype and response to mechanical loading

Keywords: Chondrocytes; Estrogen receptor-α; Mechanical loading; Mechanotransduction; Osteoarthritis; Senescence.

雖然骨關(guān)節(jié)炎（OA）的發(fā)病機(jī)制是多因素的,，但關(guān)節(jié)表面的機(jī)械超負(fù)荷是 OA 發(fā)病和進(jìn)展的已知驅(qū)動因素,。軟骨細(xì)胞衰老被認(rèn)為是OA軟骨的一個重要特征。研究表明,，人軟骨細(xì)胞在動態(tài)壓縮負(fù)荷大于20% 時,，可誘導(dǎo)衰老相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，然而,，機(jī)械負(fù)荷影響軟骨細(xì)胞衰老的機(jī)制仍有待闡明,。

研究報道，與健康對照組相比,，OA患者軟骨細(xì)胞上的雌激素受體-α（ERα）水平降低,。此外，在 OA 的體外模型中,，用促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1β（IL-1β）刺激軟骨細(xì)胞上調(diào) microRNA 203（miR-203）表達(dá),，從而拮抗 ERα 功能，導(dǎo)致炎癥增加,，細(xì)胞活性和軟骨生成基質(zhì)蛋白表達(dá)降低,。這支持ERα在介導(dǎo)軟骨細(xì)胞表型中的作用。有趣的是,，發(fā)現(xiàn)靜水壓力形式的機(jī)械負(fù)荷可以通過 ERα 調(diào)節(jié)成骨,，這支持通過 ERα 探索軟骨形成表型的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)信號。

鑒于此,，美國匹茲堡大學(xué)醫(yī)學(xué)院骨科及中國中南大學(xué)湘雅醫(yī)院骨科的研究團(tuán)隊曾證明了 ERα 是 OA 中軟骨細(xì)胞表型的重要調(diào)節(jié)因子，包括調(diào)節(jié)衰老和降解酶的產(chǎn)生,。特別是,，ERα 缺失的軟骨細(xì)胞通過顯著提高與肥大和成骨相關(guān)的分子的表達(dá)水平來響應(yīng)損傷性的機(jī)械負(fù)荷，這是 OA 軟骨中發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵特征,。因此,，恢復(fù)和維持軟骨細(xì)胞中的ERα功能可能代表了OA的未來治療干預(yù)。研究成果發(fā)表在 Osteoarthritis and Cartilage 期刊題為“Novel role of estrogen receptor-α on regulating chondrocyte phenotype and response to mechanical loading",。

首先,，研究人員從接受 TKA（全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)）的患者中收集人類 OA 膝關(guān)節(jié)軟骨組織，所有保存的軟骨均有輕微至輕度的宏觀損傷,，對照軟骨樣本表面完整,，受損軟骨樣本表現(xiàn)出嚴(yán)重的退化。

與對照軟骨相比,，受損軟骨含有較少的糖胺聚糖（GAG）,，并顯示出更高水平的MMP13、p16^INK4a 和SA-β-gal,。為了證實組織學(xué)結(jié)果,，從保存的（P-CHs）和受損（D-CHs）軟骨中分離出軟骨細(xì)胞（CHs）,，進(jìn)行qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡檢測，發(fā)現(xiàn)D-CHs在衰老,、炎癥,、纖維化、成骨和降解相關(guān)基因方面的表達(dá)水平高于P-CHs,。蛋白質(zhì)印跡分析進(jìn)一步證實了D-CHs的衰老和骨關(guān)節(jié)炎特征,，如較高水平的p16^INK4a、p21 和 MMP13,。通過檢測P-CHs和D-CHs的軟骨形成能力,，發(fā)現(xiàn)D-CHs產(chǎn)生的軟骨顆粒通常遺傳了受損軟骨的表型，如低GAG沉積和高水平的細(xì)胞衰老（圖1 A）,。

總的來說,，與保存的對照軟骨和 P-CHs 衍生組織相比，受損的軟骨和 D-CHs 衍生組織表現(xiàn)出更高水平的衰老,、炎癥,、纖維化、成骨和降解,。

由于p16^INK4a 在 D-CHs 中顯著上調(diào),，因此測試了抑制 p16^INK4a 是否可以逆轉(zhuǎn) D-CHs 中的 OA 表型（圖1 B）。結(jié)果表明,，在2D軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上,，sip16^INK4a 處理顯著降低 p16^INK4a 水平（圖1 F），并部分逆轉(zhuǎn)衰老水平（圖1 C,、D）,。但是，p16^INK4a  抑制的D-CH顆粒在軟骨生成刺激下無法產(chǎn)生軟骨（圖1 E）,，盡管軟骨生成基因水平?jīng)]有顯著受損（圖1 D）,。此外，抑制p16^INK4a 促進(jìn)了 MMP13 的表達(dá)（圖1 D,、F）,。這說明，在 D-CHs 中抑制 p16^INK4a 不會增強(qiáng) D-CHs 在體外生成健康軟骨的能力,。

圖1   通過siRNA抑制D-CHs中的p16INK4a在逆轉(zhuǎn)D-CHs的不良表型方面的益處有限,。

接下來，為了確定對照和受損組軟骨之間的差異因子,，進(jìn)行了RNA-Seq分析以檢查P-CHs和D-CHs的轉(zhuǎn)錄組,。結(jié)果顯示，D-CHs中軟骨降解相關(guān)基因的變化最大,。有趣的是,，雌激素受體家族和雌激素受體-1（ESR1）,，一種編碼雌激素受體-α（ERα）的基因，都位列上游調(diào)控因子的前5名,。與P-CHs相比,，D-CHs的ESR1表達(dá)顯著降低。ERα的下游靶點顯示,，許多與軟骨功能和OA相關(guān)的基因被預(yù)測受ERα調(diào)控,，包括p16^INK4a 。通過檢測不同樣本中的ERα水平,，驗證了ERα在嚴(yán)重?fù)p傷的軟骨中下調(diào),。

由于 D-CHs表現(xiàn)出低 ERα 表達(dá)，因此測試了升高 ERα 是否可以逆轉(zhuǎn) D-CHs 的 OA 表型,。結(jié)果表明,，增強(qiáng) ERα 水平不僅降低了衰老水平且增加了增殖潛力，同時也改善了OA表型,。這說明,，ERα 可調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞表型。

由于軟骨損傷最常見于體內(nèi)機(jī)械應(yīng)力最高的膝關(guān)節(jié)區(qū)域,，因此實驗還研究了降低的 ERα 水平是否與機(jī)械負(fù)荷有關(guān),，以及降低的 ERα 水平是否改變了軟骨細(xì)胞對機(jī)械負(fù)荷的反應(yīng)。實驗過程中使用了0.2 Hz,，0%,、5%和20%的應(yīng)變，分別代表了靜態(tài),、中等負(fù)荷和損傷性負(fù)荷的情況,。結(jié)果顯示，5% 或 20% 動態(tài)壓縮負(fù)荷下,，軟骨細(xì)胞ESR1的表達(dá)降低（圖2 B、C,、F）,。此外，20% 負(fù)荷會導(dǎo)致 siCON 細(xì)胞中分解代謝基因（如 ADAMTS4 和 MMP13）的上調(diào),，以及衰老標(biāo)志物（包括p16^INK4a 和p53）的增加（圖2 B,、D-F）。這說明,，ERα水平受機(jī)械負(fù)荷的調(diào)節(jié),。

考慮到ERα對軟骨細(xì)胞衰老和軟骨形成表型的影響，以及其對機(jī)械負(fù)荷的反應(yīng),，實驗還研究了ERα在調(diào)節(jié)壓縮負(fù)荷對軟骨細(xì)胞表型的影響中的作用,。結(jié)果顯示,，當(dāng)存在ESR1 表達(dá)時，20% 應(yīng)變下的機(jī)械負(fù)荷不再引起先前看到的p16^INK4a 和 MMP13 表達(dá)的增加,。相反,，敲低ESR1 表達(dá)時施加機(jī)械負(fù)荷會降低這兩種分子的表達(dá)（圖2 B、D-F）,。值得注意的是,，機(jī)械負(fù)荷和 ESR1 敲低都增加了 P-CHs 中磷酸化的p65（pho-p65）的水平，這是細(xì)胞應(yīng)激的代表性標(biāo)志物,。這些數(shù)據(jù)說明,，抑制 ERα 會改變軟骨細(xì)胞對壓縮負(fù)荷的反應(yīng)性。

圖2    ERα在介導(dǎo)軟骨細(xì)胞對機(jī)械負(fù)荷反應(yīng)中的作用—檢測分解代謝和衰老相關(guān)標(biāo)志物,。

最后,，實驗進(jìn)一步研究了機(jī)械負(fù)荷和ERα表達(dá)在調(diào)節(jié)軟骨生成、纖維化和成骨基因中的相互作用,。當(dāng)ESR1表達(dá)保留（siCON）時,，5% 和20% 應(yīng)變下的機(jī)械負(fù)荷對成骨或纖維化標(biāo)記基因的表達(dá)沒有顯著影響，盡管OSX和VCAN在20%壓縮應(yīng)變下顯著上調(diào)（圖3 A）,。然而,，COL2A1 存在應(yīng)變反應(yīng)性的下調(diào)（圖3 D）。有趣的是,，單獨敲除 ESR1 （0% siESR1）顯著上調(diào)了 OCN 的表達(dá),，同時抑制了 COL2A1 和軟骨寡聚基質(zhì)蛋白 （COMP） 的水平（圖3 A-D）。雖然 5% 的應(yīng)變壓縮負(fù)荷對 ESR1 敲除沒有緩解作用,，但 20% 的應(yīng)變傾向于進(jìn)一步上調(diào)肥大相關(guān)標(biāo)志物,，包括 COL10 和 OCN（圖3 B-D），同時還逆轉(zhuǎn)了 ESR1 敲除對 COL2A1 和 COMP 水平的抑制作用（圖3 D）,。值得注意的是,，與P-CHs相比，在人類的D-CHs中也觀察到OCN水平的提高（圖3 E,、F）,，并且與野生型對照相比，在從ESR1 敲除小鼠中分離的軟骨中也觀察到OCN水平增強(qiáng)（圖3 E,、G）,。這說明，ERα 的缺失和壓縮超負(fù)荷協(xié)同增加軟骨細(xì)胞的肥大轉(zhuǎn)化,。

應(yīng)該注意的是,，瞬時受體電位陽離子通道亞家族v 成員4（TRPV4）的表達(dá)是一種gongren的機(jī)械敏感 Ca2+ 通道，對機(jī)械負(fù)荷也有反應(yīng)。在siCON組中,，5% 的負(fù)荷顯著上調(diào)了TRPV4的表達(dá),，然而，較高的壓縮應(yīng)變（20%）適度降低了TRPV4的表達(dá)（圖3 D）,。此外,，ESR1敲除不會改變TRPV4蛋白水平，但確實調(diào)節(jié)了機(jī)械負(fù)荷的影響,，因為增加應(yīng)變幅度會誘導(dǎo)TRPV4表達(dá)可觀察到的劑量依賴性增加（圖3 D）,。

基于上述研究的結(jié)果，ERα在調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞表型和對機(jī)械超負(fù)荷反應(yīng)中的途徑如圖4所示,。

圖3    ERα在介導(dǎo)軟骨細(xì)胞對壓縮負(fù)荷反應(yīng)中的作用—檢測軟骨形成,、肥大、纖維化和成骨相關(guān)標(biāo)志物,。

圖4    ERα信號通路在調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞表型中的作用,。機(jī)械負(fù)荷降低健康軟骨細(xì)胞的ERα水平，這與軟骨細(xì)胞的衰老和OA轉(zhuǎn)化有關(guān),。在ERα水平降低或缺失的情況下,，其他機(jī)械傳感器將機(jī)械信號轉(zhuǎn)化為生化刺激，促進(jìn)軟骨形成,、肥大和成骨,。

總之，該研究表明,，ERα在介導(dǎo)軟骨細(xì)胞表型及其對機(jī)械負(fù)荷的反應(yīng)中具有新的雌激素非依賴性作用,，并表明提高ERα水平可能代表了一種治療骨關(guān)節(jié)炎的新方法。

參考文獻(xiàn)：Wang N, Zhang X, Rothrauff BB, Fritch MR, Chang A, He Y, Yeung M, Liu S, Lipa KE, Lei G, Alexander PG, Lin H. Novel role of estrogen receptor-α on regulating chondrocyte phenotype and response to mechanical loading. Osteoarthritis Cartilage. 2022 Feb;30(2):302-314. doi: 10.1016/j.joca.2021.11.002. Epub 2021 Nov 9. PMID: 34767957.

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