Mechano-induced cell metabolism disrupts the oxidative stress homeostasis of SAOS-2 osteosarcoma cells

Keywords: cyclic stretch; mechanobiology; metabolomics (LC-MS); osteosarcoma; oxidative stress response.

人體不斷受到物理力的影響,，這些力會改變決定細(xì)胞行為的分子特性。在實(shí)體瘤進(jìn)展過程中,，細(xì)胞會經(jīng)歷維持遷移的機(jī)械和代謝變化,。然而，關(guān)于細(xì)胞的代謝狀態(tài)如何影響其惡性特征,，反之亦然,，目前知之甚少。

骨肉瘤（OS）是zuipubian的原發(fā)性骨腫瘤,。OS細(xì)胞的機(jī)制生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn),，它們響應(yīng)于幾種細(xì)胞外力學(xué)刺激的變化來調(diào)節(jié)其惡性腫瘤。研究已經(jīng)確定了細(xì)胞外信號與化療失敗之間的密切聯(lián)系,，設(shè)想了細(xì)胞外刺激可以調(diào)節(jié)細(xì)胞毒性的可能,。骨微環(huán)境已被證明在OS的發(fā)生、進(jìn)展和復(fù)發(fā)中起著至關(guān)重要的作用,。鑒于已知大多數(shù)化療藥物會增加細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的濃度,，并可能破壞癌細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡,，因此，機(jī)械力有助于細(xì)胞中的細(xì)胞毒性過程是一個合理的假設(shè),。通常,，大多數(shù)癌細(xì)胞中發(fā)生的代謝改變被認(rèn)為有助于腫瘤發(fā)展，并介導(dǎo)對化療藥物的耐藥性,，尤其是,，OS中細(xì)胞代謝的改變，這已經(jīng)被報道與OS惡性腫瘤的等級相關(guān),。

基于此,，意大利圖西亞大學(xué)生態(tài)與生物科學(xué)系和羅馬第二大學(xué)臨床科學(xué)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)系的課題團(tuán)隊(duì)在一項(xiàng)研究中利用一種機(jī)械方案（24 h，1 Hz,，0.5% 伸長率的循環(huán)拉伸）,，通過使用非靶向質(zhì)譜方法確定SAOS-2 細(xì)胞中機(jī)械力誘導(dǎo)的代謝改變。由于幾種機(jī)械刺激被報道通過多種機(jī)制增加自由基（如活性氧和氮）的產(chǎn)生,，代謝組學(xué)分析也集中在氧化應(yīng)激穩(wěn)態(tài)的機(jī)械調(diào)節(jié)上,。此外，對參與氧化應(yīng)激防御的一些機(jī)械敏感的細(xì)胞保護(hù)基因如SOD1,，SIRT1,，FOXO1和Nrf2的表達(dá)水平進(jìn)行了比較分析，并確認(rèn)了機(jī)械誘導(dǎo)的代謝變化是否有助于骨肉瘤SAOS-2細(xì)胞對化療藥物阿霉素誘導(dǎo)的死亡變得更加敏感,。研究成果發(fā)表在 Frontiers in Molecular Biosciences 期刊題為“Mechano-induced cell metabolism disrupts the oxidative stress homeostasis of SAOS-2 osteosarcoma cells",。

將人骨肉瘤 SAOS-2 細(xì)胞暴露于特定的中等幅度單軸循環(huán)拉伸應(yīng)變方案（1 Hz，0.5%,，24h）,，進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析以評估由這種機(jī)械刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞代謝變化?；鹕綀D分析表明,，與未刺激的 SAOS-2 細(xì)胞（Ctrl對照）相比，機(jī)械拉伸細(xì)胞中有 48 種代謝物顯著下調(diào),，25 種代謝物顯著上調(diào),，主要表現(xiàn)為甘氨酸、谷氨酸,、谷氨酰胺,、天冬氨酸、精氨酸和賴氨酸等氨基酸的變化,。氨基酸水平的增加表明其在循環(huán)拉伸細(xì)胞的能量產(chǎn)生和核苷酸合成中起著核心作用,。

為了詳細(xì)研究單軸循環(huán)拉伸對能量代謝的機(jī)械調(diào)控，比較了暴露于或未暴露于0.5%伸長率單軸循環(huán)拉伸24 h的SAOS-2細(xì)胞的糖酵解（EMP）,、戊糖磷酸途徑（PPP）和三羧酸循環(huán)（TCA）,。結(jié)果觀察到,，機(jī)械拉伸細(xì)胞中葡萄糖-6-磷酸（G6P）豐度的增加（圖1），乳酸積累顯著減少,，證實(shí)了循環(huán)拉伸應(yīng)用可以逆轉(zhuǎn) SAOS-2 細(xì)胞中的 Warburg 效應(yīng)（指癌細(xì)胞代謝優(yōu)先采用糖酵解代謝而不是氧化磷酸化代謝以生成能量）,。由于PPP和EMP 在代謝上有關(guān)聯(lián)，共享共同的中間產(chǎn)物G6P,，糖酵解的增加同時導(dǎo)致PPP速率降低,，反之亦然。正如預(yù)期的那樣,，這強(qiáng)調(diào)了 1 Hz 刺激的細(xì)胞中葡萄糖從EMP 轉(zhuǎn)移到 PPP 中,。

                   圖1 與對照（Ctrl）相比，機(jī)械刺激（1 Hz）樣本中屬于糖酵解和磷酸戊糖途徑的中間體積累的變化,。

與未處理的細(xì)胞相比，拉伸刺激的 SAOS-2 細(xì)胞中,，在一些單個氨基酸濃度水平及其相關(guān)途徑的水平上也檢測到顯著差異,，如谷胱甘肽代謝的下調(diào)。轉(zhuǎn)硫途徑對谷胱甘肽的產(chǎn)生有顯著貢獻(xiàn),，它涉及將源自蛋氨酸和葉酸循環(huán)產(chǎn)生的同型半胱氨酸轉(zhuǎn)化為半胱氨酸,，再通過一系列途徑生成谷胱甘肽。有趣的是,，研究結(jié)果顯示,，與對照組相比，拉伸細(xì)胞中與蛋氨酸循環(huán)有關(guān)的代謝物下調(diào)（圖2）,。

除上述氨基酸外,，絲氨酸和甘氨酸也是這些代謝所必需的。絲氨酸轉(zhuǎn)化為甘氨酸的過程涉及維生素B6 作為必需輔酶,。這些途徑分別對核苷酸合成和甲基供體 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的生成很重要,。因此，觀察到的機(jī)械誘導(dǎo)的絲氨酸,、甘氨酸和維生素 B6 的生物活性形式的上調(diào),，使研究人員能夠假設(shè)這些代謝物不會通過葉酸循環(huán)供給蛋氨酸循環(huán)。相對于靜態(tài)組,，拉伸刺激細(xì)胞中 SAM 和 S-腺苷同型半胱氨酸水平的降低也證實(shí)了這一假設(shè),，因此它們不參與核苷酸合成和 GSH 的產(chǎn)生。

                            圖2 機(jī)械誘導(dǎo)的氨基酸和維生素B6代謝的中間體積累的變化,。

由于代謝組學(xué)分析顯示了機(jī)械處理的 SAOS-2 細(xì)胞中氧化應(yīng)激增加的幾個顯著特征,，因此，實(shí)驗(yàn)評估了 24 h+1 Hz 機(jī)械刺激是否伴隨著細(xì)胞間 ROS 的產(chǎn)生,。與靜態(tài)對照相比,，機(jī)械刺激誘導(dǎo)了1.89倍的ROS 過量生成（圖3 A）,。為了評估機(jī)械和化學(xué)刺激對 ROS 生成的協(xié)同作用，將拉伸預(yù)處理的細(xì)胞與 ROS 誘導(dǎo)劑阿霉素（一種目前用于骨肉瘤治療的化療藥物）一起孵育,。同時進(jìn)行的機(jī)械和化學(xué)刺激顯示,，ROS的生成增加；8.6 μM阿霉素處理SAOS-2-細(xì)胞24小時后ROS生成增加5倍（圖3 A）,。因此,，化學(xué)誘導(dǎo)的ROS生成掩蓋了SAOS-2細(xì)胞中靜態(tài)和拉伸誘導(dǎo)的ROS生成調(diào)節(jié)之間的差異。

基于取得的結(jié)果,，實(shí)驗(yàn)還假設(shè)拉伸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激穩(wěn)態(tài)的破壞可能導(dǎo)致機(jī)械預(yù)處理的 SAOS-2 細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞毒性致敏,。因此，采用阿霉素來測試骨肉瘤細(xì)胞對死亡的抵抗力,，用1.25-10 μM范圍內(nèi)不同濃度的阿霉素處理預(yù)拉伸和對照細(xì)胞,。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在兩種情況下,，SAOS-2 細(xì)胞都以劑量依賴性方式死亡（圖3 B）,，然而，預(yù)拉伸細(xì)胞的死亡率更高,。這表明,，1 Hz+24 h拉伸處理可使骨肉瘤細(xì)胞對阿霉素誘導(dǎo)的死亡更敏感。

由于 SOD1,、SIRT1,、Nrf2 和 FOXO-1 是機(jī)械敏感基因，在對抗氧化應(yīng)激中起重要作用,，因此使用實(shí)時 PCR 測量了其基因表達(dá)水平,。結(jié)果表明，24 h+1 Hz 機(jī)械刺激沒有顯著干擾 FOXO1 的表達(dá)水平,，但誘導(dǎo)了 SOD1 基因的上調(diào),，并同時下調(diào)了轉(zhuǎn)錄因子基因 SIRT1 和 Nrf2表達(dá)水平。這些結(jié)果表明,，1 Hz 拉伸處理增加了細(xì)胞ROS生成和SAOS-2細(xì)胞對阿霉素的敏感性,。

                          圖3 機(jī)械誘導(dǎo)的SAOS-2細(xì)胞系活性氧和細(xì)胞毒性的上調(diào)。

圖4 SAOS-2 細(xì)胞中拉伸誘導(dǎo)變化的示意圖：上圖,。細(xì)胞形態(tài)：整個細(xì)胞在循環(huán)拉伸應(yīng)變后伸長率增加,，導(dǎo)致 SAOS-2 細(xì)胞的大小顯著增加，細(xì)胞核質(zhì)比（N/C）破壞,。下圖：基因表達(dá)水平：雖然成骨分化標(biāo)志物（即 ALP,、COL1、RUNX-2）的表達(dá)水平不受機(jī)械刺激的影響，但目前數(shù)據(jù)顯示與未刺激的細(xì)胞相比,，機(jī)械刺激的細(xì)胞中 SIRT1 和 Nrf2 下調(diào),，SOD1 上調(diào)。代謝狀態(tài)：機(jī)械刺激與Warburg效應(yīng)的逆轉(zhuǎn),、谷氨酰胺代謝的上調(diào),、GSH耗竭、細(xì)胞內(nèi)ROS積累和PPP的上調(diào)有關(guān),，同時與核苷酸合成的下調(diào)有關(guān),。

總之，目前基于LC-MS的代謝組學(xué)分析顯示,，在機(jī)械1 Hz刺激后,，SAOS-2細(xì)胞中的代謝物發(fā)生了不同的顯著改變。通路分析表明,，機(jī)械刺激細(xì)胞的能量代謝被破壞,，其特征是糖酵解和三羧酸循環(huán)顯著下調(diào)，但氨基酸代謝也失調(diào)（即谷氨酰胺分解增強(qiáng),，蛋氨酸循環(huán)減少）,。反過來，在機(jī)械誘導(dǎo)的 GSH 耗竭和 ROS 富集的支持下,，研究數(shù)據(jù)表明，機(jī)械拉伸處理可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激穩(wěn)態(tài)水平的增加,，從而使 SAOS-2 細(xì)胞對阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡敏感,。這些發(fā)現(xiàn)有助于細(xì)致地了解SAOS-2細(xì)胞對機(jī)械刺激的復(fù)雜反應(yīng)，為細(xì)胞行為,、轉(zhuǎn)移和對治療藥物敏感性的潛在影響提供了有價值的見解,。

參考文獻(xiàn)：Fanelli G, Alloisio G, Lelli V, Marini S, Rinalducci S, Gioia M. Mechano-induced cell metabolism disrupts the oxidative stress homeostasis of SAOS-2 osteosarcoma cells. Front Mol Biosci. 2024 Apr 25;10:1297826. doi: 10.3389/fmolb.2023.1297826. PMID: 38726050; PMCID: PMC11079223.

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