牙頜面畸形給患者帶來了很多身心困擾,。正畸牙齒移動（OTM）是解決此問題的主要策略，通過應用固定的或可移動的機械性手段來調(diào)整牙齒排列,，這涉及牙槽骨和支撐牙周組織的生物力學適應,。引入生物療法來輔助這種機械誘導的物理運動，通過加快局部移動速度或精確增加牙槽中的牙齒錨定,，來縮短治療周期并減少患者因疼痛和不適引起的不依從性,，引起了研究人員極大的關注。現(xiàn)有的生物療法包括化學方法（細胞因子,、激素、藥物,、生長因子和其他生物物質(zhì)）和基因療法,，其中最有潛力的轉(zhuǎn)化方法是局部給藥。

辛伐他?。⊿MV）作為 HMG-CoA 還原酶抑制劑,，是一種降膽固醇的他汀類藥物。根據(jù)臨床試驗觀察,，SMV的攝入有利于慢性牙周炎的控制,，因為它具有限制炎癥和修復牙周組織的功能。動物研究表明,，全身施用 SMV 可增加牙齒錨固并減少牙根吸收,。因此，有可能假設 SMV 在生物力學誘導的炎癥條件下對牙周組織具有骨合成代謝特性,。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是絲/蘇氨酸蛋白激酶,，主要協(xié)調(diào)代謝和能量的需要。最近,，研究人員發(fā)現(xiàn)了它在誘導自噬,、炎癥控制、腫瘤轉(zhuǎn)移和自身免疫抑制中的作用,。此外,，還發(fā)現(xiàn)AMPK-α1敲除（AMPK-α1-/-）小鼠表現(xiàn)出比野生型（WT）小鼠更大的炎性牙周骨缺損，并表達更高水平的炎性細胞因子,。有趣的是,，OTM是一個生物力學過程,，伴隨著張力側(cè)骨再生和壓力側(cè)骨吸收，這表明在生物力學刺激下,，AMPK在炎癥介導的成骨過程中激活,。

目前的體外觀察基于靜態(tài)培養(yǎng)牙周膜細胞（PDLCs），這導致 PDLCs 在 OTM 期間的實際應力狀態(tài)存在很大不一致,。在華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院口腔科,、寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院口腔頜面外科及美國奧古斯塔大學牙科學院口腔生物學和診斷科學系課題組的一項聯(lián)合研究中，采用體外動態(tài)張力拉伸培養(yǎng)系統(tǒng)模擬OTM中的應力條件,，重點關注了 SMV 在嚙齒動物模型中對正畸移動牙齒張力側(cè)的抗炎作用,，并探索了AMPK調(diào)控的潛在機制。研究成果發(fā)表在 The Journal of Cellular and Molecular Medicine 期刊題為“Local delivery of simvastatin maintains tooth anchorage during mechanical tooth moving via anti-inflammation property and AMPK/MAPK/NF-kB inhibition",。

通過應用體外張力系統(tǒng)加載外部機械刺激,，將PDLCs用 10% 等雙軸應變以 0.1Hz 拉伸24小時，然后分為六組：
1. C-CON：無張力和無 SMV,；
2. C-SMV：無張力+0.05UM SMV,；
3. T-CON：僅張力；
4. T-SMV：張力+0.05UM SMV,；
5. T-Compound C：張力+0.05UM SMV+1UM Compound C（AMPK抑制劑）,；
6. T-AICAR：張力+0.05UM SMV+1UM Compound C+1MM AICAR（AMPK激活劑）。

首先,，通過比較PDLCs在藥物濃度梯度增加下的增殖率,，實驗確定了用于體外測試的適當SMV濃度，基因表達水平的變化表明,，0.05UM SMV誘導PDLCs的成骨和血管生成分化zui強,，因此選擇0.05UM SMV進行后續(xù)實驗。

SMV 具有保護性骨合成代謝和抗骨吸收特性,，接下來實驗專注于確定負責 SMV 在增加牙齒錨固方面的治療效果的內(nèi)在因素,。通過利用蛋白質(zhì)陣列技術，掃描了張力和 SMV-致敏的共刺激的PDLCs 中 20 種促炎因子和抗炎因子,，發(fā)現(xiàn)IL-6是PDLCs在共刺激下誘導的zui顯著的細胞因子,。為了檢測AMPK在SMV誘導的抗炎過程中的潛在作用，隨后測量了細胞中p-AMPK/AMPK和p-P65/P65（NF-κB）的表達水平,，數(shù)據(jù)表明,，AMPK的增加與IL-6的分泌呈負相關。

通過給藥 AMPK 抑制劑Compound C 和 AMPK 激活劑 AICAR 來分析 AMPK 信號傳導的干預,。RUNX2,、BMP-2 和 VEGF 是成骨過程中的重要因素。與靜態(tài)培養(yǎng)相比，機械張力顯著增加了BMP-2和VEGF的表達,，RUNX2表達沒有明顯的增強,。然而，SMV的加入顯著提高了三個成骨相關基因的表達水平（圖1 A-C）,。SMV給藥在靜態(tài)環(huán)境下增加促炎因子的表達,，但在張力刺激下，這種變化被逆轉(zhuǎn),，Compound C和AICAR的預處理進一步證明了這一趨勢（圖1 D）,。抑制AMPK在所有時間點均顯著升高NF-κB表達，但在加入AICAR后,，這種變化被逆轉(zhuǎn),。然而，張力培養(yǎng)條件對RUNX2表達沒有統(tǒng)計學影響（圖1 E）,，卻顯著增加了AMPK的表達,，SMV給藥在6h和12h 時協(xié)同提高了其表達水平，但Compound C 可以抑制這種變化（圖1 F）,。這些結(jié)果表明,，SMV通過抗炎作用促進OTM期間牙周組織張力側(cè)的成骨。

圖1 誘導 6 小時,、12 小時和 1 天后的實時熒光定量 PCR 檢測,。
（A）RUNX2的折疊表達。（B）BMP-2的折疊表達,。（C）VEGF的折疊表達。（D）TNF-ɑ的折疊表達,。（E）NF-κB的折疊表達,。（F）AMPK的折疊表達。

接下來,，為了進一步闡明AMPK在張力條件下對SMV刺激的PDLCs的影響,，實驗通過Western blot檢測了MAPK/NF-κB信號（圖2 A)。結(jié)果顯示,，0.05UM SMV處理下調(diào)了p-ERK,、p-P38和p-P65的折疊表達（圖2 B），但這種變化會被Compound C 改變,，并進一步被AICAR恢復,，這與p-AMPK水平呈負相關。然后通過ELISA檢測了處理的上清液中TNF-α和IL-1的表達,，發(fā)現(xiàn)張力和SMV共同刺激下TNF-α和IL-1的分泌量與NF-κB p65磷酸化水平表現(xiàn)出相似的變化模式（圖2 C）,。這說明，SMV降低了炎癥因子水平。 SMV 通過抑制 AMPK/MAPK/NF-ΚB 促進 OTM 期間牙周組織張力側(cè)的成骨,。

圖2 蛋白質(zhì)印跡分析,。
（A）AMPK、ERK1/2,、P38,、P65的蛋白表達及其磷酸化水平。（B）p-AMPK/AMPK,，p-ERK/ERK,，p-P38/P38 和 p-P65/P65 的相對牙科光學。

最后,，研究人員對實驗小鼠分別進行了手術觀察,、顯微CT評估和組織學觀察。實驗中共有24只 SD 大鼠接受了正畸矯治器放置,。在7天的預處理期間,，所有大鼠總體健康狀況良好，然后加載機械刺激,，觀察到炎癥反應有限的部位,。

然后進行顯微CT評估，對照組上頜第一磨牙遠端根部周圍出現(xiàn)大量骨吸收,，SMV組遠端根部周圍骨骼高度基本維持在分叉位置,。對照組上頜第一磨牙移動距離顯著高于SMV組和AICAR組。對照組與Compound C 組差異無統(tǒng)計學意義,。此外,，BV/TV百分比在對照組zui低，SMV組最高,，而Compound C處理使BV/TV降低,，AICAR處理使其又顯著提高。

組織學觀察的H&E染色顯示牙周組織壓力側(cè)比張力側(cè)窄（圖3 A）,。觀察遠端牙根張力側(cè)（黃色方塊內(nèi)）的牙周膜,，發(fā)現(xiàn)對照組牙周膜厚度較大，排列更混亂,，細胞核明顯長于其他三組,。同時，SMV組牙周間隙的變化受到限制,。其他三組張力側(cè)均未見明顯骨吸收部位,，如黃色箭頭所示。在SMV組中檢測到少量的炎癥細胞的流入,。Compound C組和AICAR組的組織學檢查結(jié)果介于前兩組之間,。在細胞排列方面,，Compound C組與對照組更相似。細胞核數(shù)的組織形態(tài)學評估證明了這一趨勢（圖3 B）,。具體而言,，對照組的細胞數(shù)量多于SMV組、Compound C組和AICAR組,。

免疫組織學染色顯示,，對照組移動磨牙張力側(cè)NF-κB和TNF-α表達呈強陽性。這兩個因子在SMV組中表達最弱,，然而,，在Compound C 組的牙周膜中可以看到它們均勻分散著色；兩個因子的染色細胞百分比在四組間的變化相同,，這與H&E染色的組織形態(tài)學結(jié)果相似（圖3 C,、D）。此外,，在對照組中觀察到多個紅色染色的破骨細胞,，但在SMV組和AICAR 組中幾乎沒有檢測到具有紅色破骨細胞的特征性骨吸收坑以及再吸收的骨表面。與對照組,、Compound C 組和AICAR組相比,，SMV組的Howship's lacunae（豪希普氏腔隙）數(shù)量較低。對照組與AICAR組差異均有統(tǒng)計學意義（圖3 E）,。在細胞大小和細胞數(shù)量方面,，對照組明顯大于其他3組（圖3 F）。

圖3 組織學和組織形態(tài)學檢查結(jié)果,。
（A）H&E染色,、NF-κB和TNF-ɑ免疫組織學染色，4組的Trap染色,。（B）細胞核數(shù),。（C）NF-κB陽性細胞評估。（D）TNF-ɑ陽性細胞評估,。（E）Howship's lacunae數(shù)。（F）Trap染色細胞的陽性細胞,。

總之,，該研究表明，SMV 可以通過抑制 AMPK/MAPK/NF-kB 來促進 PDLCs 中 AMPK 的內(nèi)在激活,，從而減輕在拉伸刺激下發(fā)生的炎癥,。然而，該研究主要討論了張力刺激,，不能代表牙齒在正畸力下的整體應力狀態(tài),。此外，對機械性骨形成機制的完整理解需要對破骨細胞及其反應進行識別和分析。該研究確認了AMPK/MAKP/NF-κB 通路的抑制介導 SMV 骨保護作用對 OTM 期間牙齒錨固的增強作用,。

參考文獻：Xu L, Sun X, Zhu G, Mao J, Baban B, Qin X. Local delivery of simvastatin maintains tooth anchorage during mechanical tooth moving via anti-inflammation property and AMPK/MAPK/NF-kB inhibition. J Cell Mol Med. 2021 Jan;25(1):333-344. doi: 10.1111/jcmm.16058. Epub 2020 Dec 12. PMID: 33314684; PMCID: PMC7810950.

原文鏈接：pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36151545/

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