牙骨質(zhì)是覆蓋于牙根表面的薄層礦化組織,，擔(dān)負著連接牙齒與牙周韌帶（PDL）的作用,。然而,，在機械力作用下,，牙骨質(zhì)常發(fā)生損傷，導(dǎo)致牙根外吸收和牙周組織功能障礙,。成牙骨質(zhì)細胞（Cementoblasts）分泌礦化物質(zhì)形成牙骨質(zhì)組織,，因此負責(zé)修復(fù)牙骨質(zhì)和恢復(fù)牙周功能。成牙骨質(zhì)細胞的功能受壓縮力調(diào)節(jié),，但壓縮力對成牙骨質(zhì)細胞礦化的影響仍存在爭議。

自噬（Autophagy）,，即細胞“吃掉自己"的過程,，是一種細胞自我降解和循環(huán)利用胞內(nèi)組分的過程。研究證實,，自噬囊泡負責(zé)將礦化物質(zhì)運輸?shù)郊毎饣|(zhì)（ECM）,，突出了自噬在礦化組織重塑中的作用。然而,，自噬對壓縮下成牙骨質(zhì)細胞礦化的影響尚不清楚,，調(diào)控自噬介導(dǎo)的成牙骨質(zhì)細胞變化的下游機制也需要進一步探索,。

礦化相關(guān)的信號通路，包括轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）,、Wnt 和 Hippo 通路,，作為牙根吸收的治療靶點引起了人們的興趣。越來越多的證據(jù)表明,，自噬調(diào)節(jié)許多信號通路,，包括TGF-β、Wnt和PI3K信號,。自噬和礦化相關(guān)通路之間的合作仍然知之甚少,。鑒定自噬介導(dǎo)的分子或信號通路可以為成牙骨質(zhì)細胞礦化開發(fā)新策略。

在北京大學(xué)口腔醫(yī)院口腔正畸科,、國家口腔醫(yī)學(xué)中心課題團隊的一項研究中,，闡明了壓縮力對成牙骨質(zhì)細胞礦化和自噬的影響。該研究在體外和體內(nèi)測定了自噬在壓縮下成牙骨質(zhì)細胞礦化中的作用,，然后探討了自噬作用對成牙骨質(zhì)細胞礦化作用的下游機制,，分析了自噬抑制劑處理的成牙骨質(zhì)細胞的基因表達，以鑒定參與成牙骨質(zhì)細胞礦化的分子和信號通路,。這些發(fā)現(xiàn)拓寬了對壓縮力下成牙骨質(zhì)細胞礦化背后的細胞和分子事件的理解,，并將有助于開發(fā)修復(fù)牙根吸收和牙周功能障礙的新治療靶點。相關(guān)內(nèi)容發(fā)表在Journal of Cellular Physiology 期刊題為“Autophagy mediates cementoblast mineralization under compression through periostin/β-catenin axis",。

首先,，將成牙骨質(zhì)細胞進行壓縮力負荷（1.5?g/cm2）12小時，隨后在增殖培養(yǎng)基（PM）或礦化培養(yǎng)基（MM）中孵育,，發(fā)現(xiàn)壓縮力抑制了 PM 和 MM 組中與成牙骨質(zhì)細胞礦化相關(guān)的骨鈣素（OCN）和osterix（OSX）的mRNA的表達,。蛋白質(zhì)印跡分析和ALP染色顯示，在壓縮載荷下,，成牙骨質(zhì)細胞的礦化能力降低,。

為了評估體內(nèi)正畸力下成牙骨質(zhì)細胞礦化的變化，建立了小鼠牙根吸收模型,，發(fā)現(xiàn)隨著機械力加載時間的增加,，牙齒移動距離逐漸增加，并且在施加力3周后,，在遠端頰根受壓側(cè)出現(xiàn)明顯的吸收腔隙,。IHC顯示，礦化相關(guān)蛋白OCN在受壓側(cè)的成牙骨質(zhì)細胞中表達降低,。

為了評估壓縮力對成牙骨質(zhì)細胞自噬的影響,，檢測了自噬的兩個標志物，即自噬受體 P62 的表達和 LC3-I 向 LC3-II 的轉(zhuǎn)化。蛋白質(zhì)印跡分析表明,，壓縮力增加了成牙骨質(zhì)細胞中P62的表達,，但降低了LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化（圖1 a、b）,。此外,，在受壓縮力刺激的細胞中，自噬體陽性LC3的形成顯著減少（圖1 c,、d）,，這表明壓縮力抑制了成牙骨質(zhì)細胞的自噬活性，且壓縮力導(dǎo)致成牙骨質(zhì)細胞受壓側(cè) LC3 顯著下調(diào)（圖1 e,、f）,。位于牙根表面的Cap+ 細胞上的LC3染色證實，在壓縮力作用下,，LC3+ 成牙骨質(zhì)細胞較少（圖1 g,、h）。

圖1 在壓縮力下,，自噬在成牙骨質(zhì)細胞中受到抑制,。

接下來，為了確定自噬在成牙骨質(zhì)細胞礦化中的作用,，檢測了礦化誘導(dǎo)對成牙骨質(zhì)細胞自噬的影響,，發(fā)現(xiàn)隨著誘導(dǎo)時間的延長，P62的表達減少,，而LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化增加,。然后用自噬激活劑Rapa處理成牙骨質(zhì)細胞以增強自噬或自噬抑制劑CQ抑制自噬。qRT-PCR分析表明,，Rapa處理顯著增加了成牙骨質(zhì)細胞礦化相關(guān)基因的表達,，而CQ處理降低了其表達。當(dāng)用Rapa處理細胞時,，成牙骨質(zhì)細胞的礦化能力增強,，而當(dāng)用CQ處理細胞時則相反。這說明自噬是成牙骨質(zhì)細胞礦化所必需的,。

然后實驗試圖確定壓縮力是否通過自噬調(diào)節(jié)成牙骨質(zhì)細胞礦化,，用Rapa預(yù)處理成牙骨質(zhì)細胞，然后暴露于壓縮力（圖2 a）,。在PM和MM組中,，Rapa挽救了壓縮抑制的礦化相關(guān)基因OSX和OCN的表達（圖2 b）。蛋白質(zhì)印跡分析顯示,，Rapa處理后，OSX和OCN蛋白水平在壓縮力下的下降被逆轉(zhuǎn)（圖2 c,、d）,。為了進一步證實自噬對體內(nèi)成牙骨質(zhì)細胞礦化的影響,，將小鼠全身注射Rapa并施加壓縮力3周，結(jié)果顯示,，遠端牙根力誘導(dǎo)的牙根吸收量較低,，提示注射Rapa可部分緩解牙根吸收（圖2 e、f）,。牙根受壓側(cè)的成牙骨質(zhì)細胞礦化減少,，用Rapa處理后，這種效果被逆轉(zhuǎn)（圖2 g,、h）,。由于 PDL 附著的質(zhì)量對于施加力后牙周功能恢復(fù)至關(guān)重要，因此使用 PSR 染色來評估附著在牙骨質(zhì)上的膠原纖維,，發(fā)現(xiàn)牙根面受壓側(cè)PDL附著顯著減少,，而這通過Rapa被部分逆轉(zhuǎn)（圖2 i、j）,。這說明,，壓縮力抑制的成牙骨質(zhì)細胞礦化部分依賴于自噬。

圖2 自噬恢復(fù)了受壓縮力抑制的成牙骨質(zhì)細胞的礦化,。

進一步地,，為了確定抑制自噬可抑制成牙骨質(zhì)細胞礦化的分子機制，進行了高通量RNA-seq 和GO富集分析,，以鑒定與成牙骨質(zhì)細胞礦化相關(guān)的mRNAs,。GO結(jié)果表明，4種 mRNAs（Postn,、Tnc,、Omd、Mgp）顯著下調(diào),，因此可能參與成牙骨質(zhì)細胞礦化,。用自噬抑制劑CQ處理細胞，發(fā)現(xiàn)兩個mRNAs（Postn和Tnc）顯著減少,。通過蛋白質(zhì)印跡分析和免疫熒光染色的進一步驗證確定,，在CQ處理的成牙骨質(zhì)細胞中，Postn的蛋白質(zhì)水平受到顯著抑制,，此外,，Postn在牙根表面的表達顯著降低。

然后為了確定 Postn 對成牙骨質(zhì)細胞礦化的影響,，用針對 Postn 的 siRNAs（si Postn-1/2）或?qū)φ眨∟C）轉(zhuǎn)染細胞,。結(jié)果表明，誘導(dǎo) 4 天后，敲低 Postn 顯著降低了 BSP,、OSX,、OCN 和 COL1 的基因表達（圖3 a）。BSP,、OSX 和 OCN 的蛋白質(zhì)印跡分析以及 BSP 和 OSX 的免疫熒光染色表明,，敲低 Postn 后，成牙骨質(zhì)細胞礦化受到抑制（圖3 b-e）,。ALP染色和活性顯示出類似效應(yīng)（圖3 f,、g）。這些數(shù)據(jù)表明,，敲低Postn在體外抑制了成牙骨質(zhì)細胞礦化,。此外，越來越多的證據(jù)表明,，Postn對自噬具有調(diào)節(jié)作用,。因此還研究了Postn對成牙骨質(zhì)細胞自噬的影響，發(fā)現(xiàn)隨著Postn的敲低,，自噬上調(diào),。

圖3 Postn的敲低抑制成牙骨質(zhì)細胞礦化。

由于Postn調(diào)節(jié)Wnt配體和Wnt信號的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路β-連環(huán)蛋白,，因此實驗最后進一步嘗試確定 Postn 在 Wnt/β-catenin 信號中的作用,。結(jié)果表明，Postn 敲低降低了 Wnt 靶基因的 mRNA 水平,，而 β-連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)錄水平僅受到輕微抑制,，且顯著降低了非磷酸化（活性）β-連環(huán)蛋白，并略微降低了總β-連環(huán)蛋白,。

為了進一步確定Postn是否調(diào)節(jié)β-連環(huán)蛋白的穩(wěn)定性,，用CHX（10μM）檢測了β-連環(huán)蛋白的半衰期。結(jié)果顯示,，與對照細胞相比,，Postn敲低的成牙骨質(zhì)細胞中β-連環(huán)蛋白的半衰期縮短。接下來,，用Wnt信號激動劑SKL2001（30μM）處理細胞顯著增加了對照細胞中β-連環(huán)蛋白的表達,，而在si Postn細胞中僅輕微上調(diào)β-連環(huán)蛋白，這表明Postn可能在β-連環(huán)蛋白的穩(wěn)定性中發(fā)揮作用,。

泛素化是降解β連環(huán)蛋白所必需的,。因此，用蛋白酶體抑制劑MG132（5μM）處理成牙骨質(zhì)細胞,，發(fā)現(xiàn)Postn敲低后β-連環(huán)蛋白水平降低,，MG132處理后,，這種減少被逆轉(zhuǎn)，這表明Postn以蛋白酶體依賴性方式調(diào)節(jié)β-連環(huán)蛋白的降解,。IP 分析證實,，成牙骨質(zhì)細胞中的 Postn 敲低顯著增加了 β-連環(huán)蛋白的泛素化。qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡分析確定,，通過激活β-連環(huán)蛋白逆轉(zhuǎn)了敲低Postn后礦化相關(guān)基因和蛋白質(zhì)表達的降低。這些數(shù)據(jù)說明,，敲低Postn通過促進β-連環(huán)蛋白泛素化來調(diào)節(jié)Wnt信號,。

圖4 自噬在機械壓縮下介導(dǎo)成牙骨質(zhì)細胞礦化中的作用。自噬在介導(dǎo)成牙骨質(zhì)細胞的礦化中是bi不可少的,，自噬激活是緩解壓縮力下牙根吸收所必需的,。自噬通過 Postn 調(diào)節(jié)成牙骨質(zhì)細胞礦化，Postn 進一步調(diào)節(jié) Wnt/β-catenin 信號,，部分通過調(diào)節(jié) β-catenin 的穩(wěn)定性,。

總體而言，該研究數(shù)據(jù)提供了證據(jù),，證明自噬對于恢復(fù)體外和體內(nèi)壓縮力抑制的成牙骨質(zhì)細胞礦化是bi不可少的,。研究進一步證明了自噬調(diào)節(jié)Postn的表達，并且Postn通過β-連環(huán)蛋白的泛素化部分調(diào)節(jié)成牙骨質(zhì)細胞礦化,。Postn/β-catenin軸的這種新發(fā)現(xiàn)的功能可以解釋自噬如何在壓縮力下介導(dǎo)成牙骨質(zhì)細胞礦化,，還確定了恢復(fù)牙骨質(zhì)礦化和牙周組織再生的新治療靶點。

參考文獻：Yang Y, Liu H, Wang R, Zhao Y, Zheng Y, Huang Y, Li W. Autophagy mediates cementoblast mineralization under compression through periostin/β-catenin axis. J Cell Physiol. 2023 Sep;238(9):2147-2160. doi: 10.1002/jcp.31075. Epub 2023 Jul 21. PMID: 37475648.

原文鏈接：pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37475648/

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