血流紊亂引起的動(dòng)脈粥樣硬化會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙,，激活蛋白酶水平,，并調(diào)節(jié)動(dòng)脈基質(zhì)成分,，引起血管重塑,，最終形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。血管重塑與彈性蛋白層和膠原基質(zhì)降解以及細(xì)胞外基質(zhì) （ECM） 的再分布有關(guān),。組織蛋白酶K（CTSK）是肽酶C1家族溶酶體半胱氨酸蛋白酶中zui有xiao的蛋白酶之一,，被證實(shí)參與動(dòng)脈粥樣硬化過程中ECM的重新分布。最近,，CTSK在人動(dòng)脈粥樣硬化病變的內(nèi)皮細(xì)胞,、巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)。已發(fā)現(xiàn)CTSK受氧化型LDL（OxLDL）,、細(xì)胞因子和振蕩剪切應(yīng)力的調(diào)控,。然而，血流動(dòng)力學(xué)如何傳遞和調(diào)控CTSK表達(dá)的分子機(jī)制尚不清楚,。

作為生物力學(xué)傳感器的重要候選者,，整合素在將機(jī)械刺激轉(zhuǎn)化為生化信號(hào)方面發(fā)揮著核心作用。整合素聚簇促進(jìn)β亞基的細(xì)胞質(zhì)尾部與細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架之間的動(dòng)態(tài)連接,，以形成黏著斑和細(xì)胞骨架排列,。先前的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)整合素αvβ3激活原發(fā)性血流誘導(dǎo)的NF-κB通路，并參與早期動(dòng)脈粥樣硬化炎癥,。

為了探討CTSK調(diào)控?cái)_動(dòng)流（disturbed flow）誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化形成的分子機(jī)制,，華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究室（四川）、生物流變科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（重慶）的聯(lián)合課題組構(gòu)建了小鼠左頸總局部結(jié)扎的方法構(gòu)建在體擾動(dòng)流模型,，探討擾動(dòng)流誘導(dǎo)的CTSK參與內(nèi)皮炎癥和血管重塑的機(jī)制,，檢測了αvβ3整合素和CTSK在動(dòng)脈粥樣硬化易發(fā)區(qū)的表達(dá)水平及NF-κB的激活情況。研究結(jié)果表明,，CTSK導(dǎo)致血流依賴性內(nèi)皮炎癥和血管重塑,，這有望通過靶向整合素αvβ3-細(xì)胞骨架來抑制。該研究對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的治療具有新的啟示意義,。相關(guān)結(jié)果發(fā)表于Genes & Diseases 雜志題為“Cathepsin K contributed to disturbed flow-induced atherosclerosis is dependent on Integrin-actin cytoskeleton-NF-κB pathway",。

首先，研究人員利用經(jīng)典的ApoE-/- 小鼠頸動(dòng)脈部分結(jié)扎模型建立了擾動(dòng)流模型（圖1 A）,，LCA（左頸動(dòng)脈）和升主動(dòng)脈（AA）區(qū)域暴露于擾動(dòng)流,，而RCA（右頸動(dòng)脈）和降主動(dòng)脈（DA）區(qū)域暴露于穩(wěn)定的層流。ORO染色和H&E 染色證實(shí),，小鼠左頸總血管脂質(zhì)沉積增多,，直徑增大、內(nèi)膜厚度增加以及彈性蛋白層破裂（圖1 B-G）,。這些結(jié)果表明,，擾動(dòng)流會(huì)加速ApoE-/- 小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成。

為了排除血清膽固醇水平和脂質(zhì)沉積對(duì)血管炎癥和重構(gòu)的影響,，實(shí)驗(yàn)使用正常血脂小鼠的部分頸動(dòng)脈結(jié)扎模型進(jìn)行體內(nèi)擾動(dòng)流實(shí)驗(yàn),，檢驗(yàn)了NF-κB負(fù)責(zé)流動(dòng)誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥的假設(shè),。結(jié)果在不同流動(dòng)區(qū)域的ECs中檢測到在NF-κB家族中起關(guān)鍵作用的p65，由體內(nèi)層流區(qū)的細(xì)胞質(zhì)易位至 LCA 和 AA 區(qū)域的細(xì)胞核中,，表明 NF-κB 的激活,。qRT-PCR結(jié)果顯示，LCA區(qū)域炎癥相關(guān)mRNA（IL-1β,、IL-6、TNF-α和p65）顯著升高,。此外,，在正常小鼠中，血流紊亂導(dǎo)致新內(nèi)膜增生而無脂質(zhì)沉積,，彈性蛋白層斷裂增多,。這些結(jié)果表明，在動(dòng)脈粥樣硬化形成的開始和進(jìn)展過程中,，擾動(dòng)流引起的血管炎癥和重塑與血清膽固醇水平或動(dòng)脈壁中的脂質(zhì)沉積無關(guān),。

圖1 血流紊亂會(huì)誘發(fā)左頸動(dòng)脈（LCA）的動(dòng)脈粥樣硬化和血管重構(gòu)。

據(jù)研究,，CTSK可能參與了由擾動(dòng)流引起的血管重塑和血管炎癥,。因此，接下來檢測了CTSK和Col1-A在結(jié)扎ApoE-/- 小鼠中的分布,。結(jié)果觀察到 CTSK 和 Col1-A 的共定位,，表明 CTSK 可能通過降解 I 型膠原來重塑細(xì)胞外基質(zhì)。21 天后,，C57BL/6小鼠在擾動(dòng)流區(qū)域ECs（LCA,，AA）中CTSK表達(dá)、蛋白質(zhì)和mRNA水平均顯著高于層流區(qū)（RCA,，DA）的表達(dá),。然后研究了在促動(dòng)脈粥樣硬化區(qū)域擾動(dòng)流誘導(dǎo)CTSK的分子過程。在前人研究的基礎(chǔ)上,，該研究提出將整合素作為擾動(dòng)流中的機(jī)械介質(zhì),，促進(jìn)CTSK的表達(dá)。因此,，實(shí)驗(yàn)使用部分頸動(dòng)脈結(jié)扎模型在 LCA 和彎曲的AA 中創(chuàng)建擾血流,。免疫熒光圖像顯示，C57BL/6小鼠結(jié)扎21 天后LCA和AA的整合素αv和β3水平顯著高于RCA組和DA組,。

此外,，采用體外剪切力加載裝置在體外產(chǎn)生單向?qū)恿鲬?yīng)力（LSS）或擾動(dòng)剪切應(yīng)力（DSS），HUVECS暴露于LSS（15 dyn/cm2）或DSS（± 4.5 dyn/cm2）分別持續(xù) 8 小時(shí),。與LSS或靜態(tài)對(duì)照相比,，DSS升高了Ser536位點(diǎn)磷酸化p65的表達(dá)水平（圖2 A）,。體外研究證實(shí)，p65蛋白在DSS誘導(dǎo)的HUVECs中從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核8小時(shí)（圖2 B）,。強(qiáng)度曲線顯示,，DSS條件下p65蛋白和細(xì)胞核具有明顯的共定位性（圖2 B）。由于DSS誘導(dǎo)的p65蛋白磷酸化可促進(jìn)NF-κB活化并導(dǎo)致細(xì)胞炎癥,，實(shí)驗(yàn)通過qRT-PCR評(píng)估了不同流動(dòng)條件下HUVECs中促炎mRNA的mRNA表達(dá),，與LSS或靜態(tài)對(duì)照相比，DSS顯著上調(diào)mRNA（IL-1β,、IL-6,、TNF-α和IL-8）的定量表達(dá)（圖2 C）。

通過Western blot檢測CTSK在暴露于不同流動(dòng)條件的HUVECs中的表達(dá),，結(jié)果表明,，DSS顯著提高了HUVECs中CTSK的水平（圖2 D），與體內(nèi)模型的結(jié)果一致,。qRT-PCR結(jié)果進(jìn)一步證實(shí),，DSS顯著增強(qiáng)了CTSK的mRNA表達(dá)（圖2 E）。I型膠原是CTSK的底物,，CTSK可使I型膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)斷裂,。在靜態(tài)對(duì)照組和LSS組I型膠原纖維明顯突出，而DSS組的CTSK水平高,，I型膠原纖維明顯減少（圖2 F）,。這些結(jié)果表明，DSS可以促進(jìn)CTSK的表達(dá)并降解基質(zhì),，最終導(dǎo)致血管重塑,。此外，發(fā)現(xiàn)DSS組整合素αv和β3的表達(dá)明顯高于LSS組或靜態(tài)對(duì)照組（圖2 G）,。綜上所述,，DSS可誘導(dǎo)內(nèi)皮炎癥和ECM再分布，并伴有高水平的CTSK和整合素αvβ3表達(dá),。

圖2 DSS 在體外誘導(dǎo)內(nèi)皮炎癥并增加 CTSK 表達(dá),。

進(jìn)一步地，實(shí)驗(yàn)想要闡明整合素如何介導(dǎo)剪切誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化變化,。上述結(jié)果表明,，DSS誘導(dǎo)p65，在西侖吉肽（整合素αvβ3的特異性抑制劑）和ATN-161（整合素α5β1抑制劑）存在下,，可以重新分布到細(xì)胞質(zhì),，這表明內(nèi)皮炎癥可以通過抑制整合素wan全減弱。通過使用西倫吉肽或ATN-161,，可以發(fā)現(xiàn)肌動(dòng)蛋白纖維沒有明顯差異（圖3 A,、B）,。

qRT-PCR結(jié)果顯示，DSS組促炎因子（IL-6,、TNF-α,、ICAM-1、p65和IL-8）的mRNA表達(dá)水平顯著低于預(yù)阻斷整合素的LSS組（圖3 C）,。相比之下,，暴露于LSS通過抑制整合素顯著提高CTSK水平（圖3 D）。采用細(xì)胞骨架聚合抑制劑latrunculin B（LatB,、10μM,、12h）探究不同流動(dòng)條件下整合素誘導(dǎo)的細(xì)胞骨架排列和炎癥反應(yīng)。抑制細(xì)胞骨架排列后,，肌動(dòng)蛋白應(yīng)激紊亂，板足前緣偽足少且短,，血流依賴性內(nèi)皮炎癥增強(qiáng),。

使用 IκB/IKK 抑制劑 BAY 11-7085（10 μM、12h）,，進(jìn)一步研究了 NF-κB 對(duì)暴露于 DSS 或 LSS 的 HUVECs 中 CTSK 表達(dá)的影響,，可以發(fā)現(xiàn)，DSS通過抑制NF-κB通路的激活顯著降低了CTSK的表達(dá)（圖3 E）,。這些結(jié)果表明,，整合素-細(xì)胞骨架介導(dǎo)血流誘導(dǎo)的NF-κB激活和血管重構(gòu)。

圖3 擾動(dòng)流誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥,，具體取決于整合素-NF-κB軸,。

基于上述體外研究結(jié)果，細(xì)胞表面整合素受體可作為潛在的治療靶點(diǎn),。因此,，實(shí)驗(yàn)測試了整合素抑制劑西侖吉肽（5 μg/kg/d）在頸動(dòng)脈結(jié)扎模型中的抗炎作用。結(jié)果表明,，整合素阻斷可以減輕正常血脂小鼠的炎癥和重塑,。

最后實(shí)驗(yàn)評(píng)估了整合素阻斷在DSS誘導(dǎo)的加速動(dòng)脈粥樣硬化中的保護(hù)特性。西侖吉肽組頸動(dòng)脈結(jié)扎后高脂血癥小鼠LCA和AA區(qū)域的脂質(zhì)沉積明顯低于二甲基亞砜對(duì)照組（圖4 A,、B）,。同時(shí)，免疫熒光圖像顯示,，西侖吉肽給藥后動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中CTSK的表達(dá)降低（圖4 C）,。此外，還發(fā)現(xiàn)整合素的抑制可以降低CTSK和Col1-A的共定位,。H&E染色結(jié)果顯示,，整合素阻斷可顯著降低結(jié)扎后21 天高脂血癥患者動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)展和血管平均直徑（圖4 D,、E）。此外,，與二甲基亞砜對(duì)照組相比,，西侖吉肽組LCA中彈性蛋白的內(nèi)側(cè)直徑和破裂次數(shù)均減少（圖4 F-H）。這些結(jié)果說明,，整合素阻斷可減少擾動(dòng)流誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化,。

圖4 整合素阻斷可減少血流紊亂誘發(fā)的動(dòng)脈粥樣硬化。

總之,，該研究的發(fā)現(xiàn)揭示了擾動(dòng)流導(dǎo)致CTSK表達(dá)的增加,，并導(dǎo)致內(nèi)皮炎癥和血管重塑，最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化,，而這取決于整合素 αvβ3-細(xì)胞骨架-NF-κB 信號(hào)軸,。此外，整合素αvβ3-細(xì)胞骨架的抑制有望成為血管抗炎和抗動(dòng)脈粥樣硬化治療的靶點(diǎn),。

參考文獻(xiàn)：Fang F, Feng T, Li J, Zhang H, Wang Q, Chen Y, Wang G, Shen Y, Liu X. Cathepsin K contributed to disturbed flow-induced atherosclerosis is dependent on integrin-actin cytoskeleton-NF-κB pathway. Genes Dis. 2022 Apr 25;10(2):583-595. doi: 10.1016/j.gendis.2022.03.020. PMID: 37223522; PMCID: PMC10201601.

原文鏈接：pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37223522/

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