骨關(guān)節(jié)炎（OA）是最常見的慢性關(guān)節(jié)疾病,。軟骨的健康是通過對(duì)機(jī)械刺激的響應(yīng)來維持的,，壓縮或拉伸應(yīng)變形式的機(jī)械負(fù)荷在軟骨細(xì)胞中具有抗炎作用,，并阻斷促炎介質(zhì)一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE2）的釋放，以響應(yīng)白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）,。炎癥信號(hào)傳導(dǎo)導(dǎo)致OA中的軟骨退化,，因此了解機(jī)械負(fù)荷與炎癥之間的聯(lián)系會(huì)對(duì)治療產(chǎn)生重大的影響。

瞬時(shí)感受器電位離子通道香草素受體4（TRPV4）是一種Ca2?可滲透的非選擇性陽離子通道,，在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中高度表達(dá),，并被機(jī)械刺激激活。TRPV4 是軟骨細(xì)胞和其他細(xì)胞類型機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的,，它介導(dǎo)促合成代謝和抗分解代謝基因的調(diào)控,，促進(jìn)軟骨中細(xì)胞的增殖和基質(zhì)的產(chǎn)生，而這兩者都會(huì)影響關(guān)節(jié)的生長(zhǎng),。TRPV4 定位于質(zhì)膜和初級(jí)纖毛,。初級(jí)纖毛參與了軟骨細(xì)胞機(jī)械傳導(dǎo)和炎癥信號(hào)傳導(dǎo)。研究已經(jīng)報(bào)道了機(jī)械負(fù)荷通過與鞭毛內(nèi)運(yùn)輸（IFT）/纖毛改變相關(guān)的組蛋白脫乙?；?（HDAC6）激活與來抵消炎癥信號(hào),，以響應(yīng)促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1β（IL-1β）。TRPV4 在該途徑中的作用尚未確定,。

基于此,，在英國(guó)倫敦瑪麗女wang大學(xué)工程與材料科學(xué)學(xué)院研究團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，shou次證明了通過循環(huán)拉伸應(yīng)變（CTS）,、低滲透刺激或 TRPV4 選擇性激活劑GSK1016790A 激活 TRPV4 可抑制促炎性 IL-1β 信號(hào)傳導(dǎo)和與初級(jí)纖毛伸長(zhǎng)改變相關(guān)的軟骨降解,。因此，TRPV4 可能為治療關(guān)節(jié)疾病和其他炎癥病變提供新的靶點(diǎn),。相關(guān)內(nèi)容發(fā)表在Osteoarthritis AND Cartilage 期刊題為“Activation of TRPV4 by mechanical, osmotic or pharmaceutical stimulation is anti-inflammatory blocking IL-1β mediated articular cartilage matrix destruction",。

首先,，IL-1β 處理（1-10 ng/ml濃度，24h）導(dǎo)致 NO 和 PGE2 的顯著劑量依賴性釋放,，而CTS（0.33 Hz,，0-10% 應(yīng)變，24 h）形式的機(jī)械載荷顯著降低了這種反應(yīng),。IL-1β誘導(dǎo)的NO釋放被CTS消除,，因此1或10 ng/ml均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CTS在1 ng/ml IL-1β濃度下wan全抑制PGE2的釋放,，但在10 ng/ml濃度下僅部分抑制PGE2的釋放,。用TRPV4拮抗劑GSK205（10μM）同時(shí)處理可消除機(jī)械負(fù)荷的抗炎作用。此外，GSK205 在有或沒有 IL-1β 的無負(fù)載細(xì)胞中對(duì) NO 或 PGE2 釋放沒有影響,，但在有 IL-1β 的負(fù)載細(xì)胞中 IL-1β 效應(yīng)可被恢復(fù),，NO 和PGE2 釋放均被IL-1β顯著提高。無論是否存在 CTS,，IL-1β 和 GSK205 處理均不影響 TRPV4 蛋白水平,。這些數(shù)據(jù)表明，機(jī)械負(fù)荷的抗炎作用是由 TRPV4 激活介導(dǎo)的,。

接下來,，實(shí)驗(yàn)將分離的軟骨細(xì)胞用高滲透壓培養(yǎng)基（400 mOsm）、低滲透壓培養(yǎng)基（200 mOsm）或等滲透壓培養(yǎng)基（315 mOsm）處理24小時(shí)（圖1 A,、B）,。結(jié)果表明，無論是否存在IL-1β ,，與等滲對(duì)照相比,，高滲透刺激對(duì)NO釋放沒有顯著影響，而低滲透刺激顯著減弱了IL-1β（1 ng/ml）的促炎反應(yīng),，使得24 h時(shí)NO釋放的增加顯著降低（圖1 A）,，但對(duì)細(xì)胞活力沒有明顯影響（圖1 B）。在GSK205存在下,，wan全抑制了低滲透刺激對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的NO釋放的抗炎作用,，使得NO釋放的效果與對(duì)照條件沒有顯著差異（圖1 A）。

在軟骨外植體中,，低滲透刺激顯著降低了 IL-1β 誘導(dǎo)的 NO 釋放（圖1 C）,，而且阻斷了IL-1β介導(dǎo)的sGAG釋放，表明細(xì)胞外基質(zhì)降解減少,。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，軟骨細(xì)胞活力保持不變（圖1 D）,。與分離的細(xì)胞一致,，在存在或不存在 1 ng/ml IL-1β 的情況下，高滲透刺激對(duì) NO 或 sGAG 釋放沒有影響,。GSK205 處理恢復(fù)了低滲透介質(zhì)中 IL-1β 誘導(dǎo)的 NO 釋放從而阻斷滲透激發(fā)的抗炎作用（圖1 C）,。有趣的是，GSK205 進(jìn)一步增加了 IL-1β 誘導(dǎo)的 NO 在等滲對(duì)照培養(yǎng)基中的釋放,，這在分離細(xì)胞中未見（圖1 C）,。這些數(shù)據(jù)共同表明，低滲透壓負(fù)荷的抗炎作用也是由 TRPV4 激活介導(dǎo)的,。

圖1 低滲透刺激在分離的軟骨細(xì)胞和軟骨外植體中通過 TRPV4 依賴性途徑抑制 IL-1β 介導(dǎo)的 NO 釋放,。

IL-1β 誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的初級(jí)纖毛伸長(zhǎng)，并通過調(diào)節(jié) IFT 介導(dǎo)下游分解代謝 NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)。因此,，實(shí)驗(yàn)研究了初級(jí)纖毛在TRPV4激活的抗炎機(jī)制中的參與,。在分離的軟骨細(xì)胞中觀察到 TRPV4 纖毛定位，通過機(jī)械負(fù)荷,、低滲透刺激或GSK101（1 nM）激活 TRPV4 會(huì)增加 TRPV4 纖毛定位,，但對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)沒有顯著影響。這些數(shù)據(jù)提示了 IFT 的改變,。

在分離的軟骨細(xì)胞中,，IL-1β（1ng / ml）處理24h可誘導(dǎo)初級(jí)纖毛長(zhǎng)度從中位數(shù)2.21-2.84 μm顯著增加，而GSK101 激活 TRPV4 而消除這種效應(yīng),。IL-1β介導(dǎo)的纖毛伸長(zhǎng)也被機(jī)械負(fù)荷（CTS,，0-10%，0.33 Hz） 和低滲透刺激阻斷,。GSK205抑制TRPV4恢復(fù)了IL-1β介導(dǎo)的纖毛在機(jī)械負(fù)荷和低滲透刺激下的伸長(zhǎng),。這些數(shù)據(jù)表明，TRPV4激活與初級(jí)纖毛定位改變有關(guān)并調(diào)節(jié)纖毛長(zhǎng)度,。

然后,，實(shí)驗(yàn)研究了 TRPV4 的直接藥物激活是否會(huì)復(fù)制機(jī)械和滲透負(fù)荷的抗炎作用。IL-1β （1 ng/ml）誘導(dǎo)離體軟骨細(xì)胞中NO和PGE2釋放的特征性上調(diào),，而GSK101可以消除這種上調(diào)（圖2 A,、B）。同樣,，IL-1β 誘導(dǎo)的 COX2 表達(dá)被 GSK101 消除（圖2 C）,。

此前，已經(jīng)確定了 HDAC6 激活和轉(zhuǎn)錄后微管蛋白修飾在機(jī)械負(fù)荷抗炎作用中的機(jī)制作用,。同樣,，GSK101 導(dǎo)致 HDAC6 活性顯著上調(diào)（圖2 D），表明 TRPV4 介導(dǎo)的鈣信號(hào)激活 HDAC6,。與這一發(fā)現(xiàn)一致,，實(shí)驗(yàn)觀察到顯著的微管蛋白去乙酰化,，伴隨著非聚合的可溶性微管蛋白池的減少（圖2 E-F）,。此外，HDAC6 特異性抑制劑 Tubacin（500 nM）恢復(fù)了 IL-1β 介導(dǎo)的 GSK101 處理細(xì)胞中 NO 的釋放（圖2 G）,。這些數(shù)據(jù)表明,，GSK101 模擬了機(jī)械負(fù)荷對(duì) IL-1β 炎癥信號(hào)傳導(dǎo)、HDAC6 激活和微管蛋白修飾的影響,。

圖2 TRPV4 激活通過 HDAC6 激活消除 IL-1β 炎癥信號(hào)傳導(dǎo),。

最后，實(shí)驗(yàn)確定了TRPV4的藥物激活是否可以防止軟骨退化和機(jī)械性能的喪失，將軟骨外植體在1nM或10nM GSK101存在下用IL-1β處理12天,。在IL-1β處理下,，觀察到顯著的NO釋放（圖3 A），表明炎癥信號(hào)的激活,。這種反應(yīng)伴隨隨顯著的 sGAG 釋放,，表明軟骨退化（圖3 B）。

然后使用單軸無側(cè)限壓縮測(cè)量軟骨組織的粘彈性,，以確定 GSK101 是否可以防止 IL-1β 引起的機(jī)械性能喪失,。軟骨外植體呈現(xiàn)出以切線模量為15-20 MPa的非線性應(yīng)力-應(yīng)變曲線（圖3 C）。隨后在20% 應(yīng)變下粘彈性應(yīng)力松弛（圖3 D）,，在300秒下松弛模量為2-3 MPa,，代表80%的松弛，松弛半衰期約為50秒（圖3 E-H）,。IL-1β處理導(dǎo)致機(jī)械剛度急劇下降,，如切線模量（圖3 E）和松弛模量（圖3 F）的顯著降低，松弛百分比增加（圖3 G）和半衰期減少（圖3 H）,。

GSK10顯著抑制IL-1β處理后軟骨外植體NO的累積釋放（圖3 A）,。同樣，sGAG的累積釋放也顯著減少,，并且響應(yīng)IL-1β的機(jī)械性能喪失被消除,，因此在有和沒有IL-1β的情況下，任何生物力學(xué)參數(shù)都沒有顯著差異,。這些數(shù)據(jù)表明,，TRPV4 激活消除了 IL-1β 介導(dǎo)的軟骨退化和機(jī)械性能喪失。

圖3 TRPV4 激活抑制 IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨外植體中 NO 釋放,、基質(zhì)降解和機(jī)械性能喪失,。

總之，該研究證明了 TRPV4 激活在負(fù)荷下的抗炎機(jī)制中的作用,。除了為該通路提供新的機(jī)制理解外,，該研究還將 TRPV4 確定為潛在的治療靶點(diǎn)，并證明該蛋白的藥物激活可以調(diào)節(jié)炎癥和其他涉及軟骨疾病的 IFT 依賴性通路,。

參考文獻(xiàn)：Fu S, Meng H, Inamdar S, Das B, Gupta H, Wang W, Thompson CL, Knight MM. Activation of TRPV4 by mechanical, osmotic or pharmaceutical stimulation is anti-inflammatory blocking IL-1β mediated articular cartilage matrix destruction. Osteoarthritis Cartilage. 2021 Jan;29(1):89-99. doi: 10.1016/j.joca.2020.08.002. PMID: 33395574; PMCID: PMC7799379.
原文鏈接：pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33395574/

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