內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）在體內(nèi)持續(xù)暴露于血流動(dòng)力學(xué)剪切應(yīng)力,。當(dāng)ECs感知剪切應(yīng)力時(shí),，它們會(huì)改變細(xì)胞形態(tài)、功能和基因表達(dá),，并參與生理和病理血管生物學(xué),。對(duì)此，在血管中報(bào)道了兩種類(lèi)型的剪切應(yīng)力：一種是層流剪切應(yīng)力,，另一種是擾動(dòng)剪應(yīng)力,。層流剪切應(yīng)力（LSS）具有血管保護(hù)作用，位于直動(dòng)脈區(qū)域（如胸主動(dòng)脈）,，而擾動(dòng)剪切應(yīng)力（DSS）對(duì)血管有害,，并且位于分支或彎曲區(qū)域（例如主動(dòng)脈弓）。有趣的是,，研究表明,，血管分支所在的血管通透性增加，動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)也隨之增加,。

剪切應(yīng)力的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)是復(fù)雜的,。可以粗略地確定,，剪切應(yīng)力通過(guò)細(xì)胞膜分子激活各種傳導(dǎo)途徑,，包括鈣通道、G蛋白,、酪氨酸激酶受體,、粘附蛋白和細(xì)胞骨架。在剪切應(yīng)力作用下,，ECs最直觀的表型是形態(tài)變化：ECs經(jīng)歷了從多邊形鵝卵石狀向均勻紡錘狀單層的轉(zhuǎn)變,。這種現(xiàn)象被認(rèn)為部分是F-肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維誘導(dǎo)的結(jié)果，然而,，由于剪切應(yīng)力導(dǎo)致的這種細(xì)胞骨架組的機(jī)制尚不清楚,。

Latexin （LXN） 是一種長(zhǎng) 222 個(gè)氨基酸的羧肽酶抑制劑。由于其蛋白酶抑制劑的特性,，人們認(rèn)為L(zhǎng)XN可能參與蛋白質(zhì)降解和代謝,。LXN 也與炎癥有關(guān)，因?yàn)樗诰奘杉?xì)胞和肥大細(xì)胞中表達(dá)，并且可以由脂多糖誘導(dǎo),。然而,，LXN在ECs中的作用尚不清楚。

基于此,，在廣西師范大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,、廣西民族藥省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心及桂林醫(yī)學(xué)院智能醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院課題團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究中，發(fā)現(xiàn)層流剪切應(yīng)力誘導(dǎo) ECs 中 LXN 的下調(diào),，從而導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)變化和 F-肌動(dòng)蛋白重塑,，類(lèi)似于 LSS 在 ECs 中的作用那樣。從邏輯上講,，研究人員假設(shè) LXN 是一種新型調(diào)節(jié)因子,，參與內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)變化過(guò)程，并且 LXN 缺失對(duì)血管穩(wěn)態(tài)具有保護(hù)作用,。研究成果發(fā)表在 Journal of Cellular and Molecular Medicine 期刊題為“LXN deficiency regulates cytoskeleton remodelling by promoting proteolytic cleavage of Filamin A in vascular endothelial cells",。

首先，HUVECs承受15 dynes/cm2 的層流剪切應(yīng)力持續(xù)12小時(shí)（圖1）,，結(jié)果觀察LSS誘導(dǎo)細(xì)胞形狀變化（圖1 A）,，上調(diào)血管保護(hù)基因（如CPY1B1、THBD和NOS3）,，但下調(diào)促動(dòng)脈粥樣硬化基因（如VCAM1,、CD36和ANGPT2）（圖1 B）。有趣的是,，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LSS以時(shí)間依賴(lài)性方式顯著抑制HUVECs中LXN的表達(dá)（圖1 C-E）,，這促使研究人員思考LXN是否參與了ECs的功能調(diào)控。

為了探究LXN在內(nèi)皮細(xì)胞中的功能作用,，采用功能缺失策略,。QPCR結(jié)果顯示，LXN敲低降低了HUVECs中ANGPT2,，但增加了THBD和NOS3的表達(dá),，表明 LXN 敲低在 ECs 中具有血管保護(hù)功能。有趣的是,，在LXN敲低ECs中觀察到細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化和細(xì)胞骨架重塑,，與LSS引起的ECs形態(tài)變化相似（圖1 A）。轉(zhuǎn)染CTL siRNA的ECs形態(tài)隨機(jī)排列,，呈均勻多邊形,，而用 LXN siRNA 轉(zhuǎn)染的 ECs 從典型的鵝卵石狀拉長(zhǎng)到均勻紡錘狀排列，其方向與在LSS下生長(zhǎng)的細(xì)胞在外觀上相似,，并且LSS誘導(dǎo)的ECs形態(tài)變化可通過(guò)LXN的過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn),。

通過(guò)F-肌動(dòng)蛋白染色進(jìn)一步研究了LXN缺失對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞骨架重塑的影響,。結(jié)果觀察到，LXN敲低導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維的形成,，主要在ECs中F-肌動(dòng)蛋白絲的縱向分布中運(yùn)行,。有趣的是，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ECs在對(duì)照條件下表現(xiàn)出大而頻繁的板狀偽足形成,，然而,，LXN敲低細(xì)胞中的板狀偽足形成減少。這些數(shù)據(jù)清楚地表明,，LXN至少參與了ECs中的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)變化和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組。

圖1 層流剪切應(yīng)力下調(diào)HUVECs中LXN的表達(dá),。

接下來(lái),，為了探究LXN調(diào)控內(nèi)皮形態(tài)的機(jī)制，進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)篩選,，以鑒定ECs中LXN的細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn),，為此，裂解HUVECs,，并用抗LXN抗體進(jìn)行免疫沉淀,。FLNA是一種支架蛋白，被確定為L(zhǎng)XN的潛在伴侶,，通過(guò)免疫沉淀和蛋白質(zhì)印跡進(jìn)一步驗(yàn)證了這種相互作用,。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了內(nèi)源性LXN在HUVECs中與FLNA完quan形成物理復(fù)合物。數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明,，F(xiàn)LNA 可能參與與 LXN 的結(jié)合并在 ECs 中形成復(fù)合物,。

細(xì)絲蛋白A（Filamin A，F(xiàn)LNA）是一種肌動(dòng)蛋白交聯(lián)蛋白,，可調(diào)節(jié)與細(xì)胞形態(tài)變化和運(yùn)動(dòng)有關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件,。由于 LXN 調(diào)節(jié)細(xì)胞形狀，因此在研究中觀察到 ECs 中細(xì)胞骨架的變化和肌動(dòng)蛋白重塑,。LXN與FLNA的相互作用促使研究人員評(píng)估了LXN是否影響ECs中的FLNA蛋白水平,。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LXN敲低不影響FLNA的mRNA水平（圖2 A）,，但顯著降低了ECs中FLNA的蛋白水平（圖2 B）,。有趣的是，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)大約190 kD的新條帶,，它也可以被FLNA抗體識(shí)別,，表明FLNA可能被降解（圖2 B）。FLNA對(duì)鈣蛋白酶的蛋白水解非常敏感,，因此,，實(shí)驗(yàn)推測(cè)LXN是否調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞中的鈣蛋白酶活性,。

實(shí)驗(yàn)觀察到，LXN敲低ECs中的鈣蛋白酶活性增加（圖2 C）,。因此,，用鈣蛋白酶抑制劑Calpeptin處理LXN敲低ECs，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡測(cè)定FLNA及其片段,，發(fā)現(xiàn)LXN敲低導(dǎo)致FLNA減少,，同時(shí)FLNA裂解增加，然而,，這種作用可以通過(guò)Calpeptin抑制（圖2 D）,。隨后通過(guò)免疫染色和蛋白質(zhì)印跡進(jìn)一步確定了LXN敲低是否會(huì)影響ECs中全長(zhǎng)和裂解的FLNA亞細(xì)胞定位。免疫染色顯示,，F(xiàn)LNA與LXN在細(xì)胞質(zhì)中共定位,，LXN敲低顯著促進(jìn)了ECs中FLNA從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的亞細(xì)胞易位（圖2 E、F）,。有趣的是,，Calpeptin可以逆轉(zhuǎn)LXN敲低誘導(dǎo)的應(yīng)力纖維的形成（圖2 G）。這些數(shù)據(jù)表明,，LXN維持了FLNA在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定性,，而LXN缺失通過(guò)鈣蛋白酶依賴(lài)性途徑下調(diào)FLNA，促進(jìn)FLNA細(xì)胞核易位,。

圖2 LXN 敲低調(diào)節(jié) EC 中的 FLNA 蛋白水解裂解和亞細(xì)胞定位,。

然后，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了LXN敲低是否會(huì)影響細(xì)胞骨架蛋白的穩(wěn)定性,。結(jié)果顯示,，敲低LXN后整合素-β表達(dá)略有升高，而paxillin,、Arp2/3和α-actinin表達(dá)顯著降低（圖2 H）,。由于據(jù)報(bào)道，樁蛋白（paxillin）與黏著斑（FA）和細(xì)胞骨架錨定的形成有關(guān),，因此接下來(lái)研究了 FLNA 是否對(duì) ECs 中的細(xì)胞骨架錨定有影響,，如圖所示4 I、F,，在對(duì)照細(xì)胞中隨機(jī)排列的肌動(dòng)蛋白絲與其末端與黏著斑相連,。

然而，在LXN敲低細(xì)胞中,，肌動(dòng)蛋白絲與黏著斑之間的關(guān)聯(lián)被破壞,，黏著斑等結(jié)構(gòu)消失，從而導(dǎo)致F-肌動(dòng)蛋白絲在細(xì)胞縱向上的分布,，以及形態(tài)學(xué)變化（圖2 I-i）,。接下來(lái),，又敲除ECs中的FLNA（圖2 J），發(fā)現(xiàn)斑塊等局灶性粘附受損,，并導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維的形成,，主要在EC中F-肌動(dòng)蛋白絲的縱向分布中運(yùn)行（圖2 J-vi），這表明ECs中FLNA的減少有助于應(yīng)力纖維的形成,。這些數(shù)據(jù)顯示了,，LXN作為FLNA蛋白質(zhì)復(fù)合物的功能作用，參與調(diào)節(jié)ECs中黏著斑形成和肌動(dòng)蛋白絲的錨定,。

最后,，為了評(píng)估LXN在體內(nèi)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的作用，對(duì)WT和LXN-/- 小鼠主動(dòng)脈弓內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行染色,，觀察細(xì)胞形態(tài)變化和細(xì)胞骨架分布,，結(jié)果表明，LXN在體內(nèi)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)變化和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組,。接下來(lái)，評(píng)估了LXN缺失對(duì)體內(nèi)血管功能的影響,，數(shù)據(jù)表明,，LXN敲除顯著降低了微血管的通透性。

然后進(jìn)一步評(píng)估了LXN缺失在動(dòng)脈粥樣硬化中的血管保護(hù)作用,，實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了 ApoE‐/- LXN‐/‐ 型雙基因敲除小鼠,，用高脂飲食喂養(yǎng)小鼠16周，建立動(dòng)脈粥樣硬化模型,。血管舒張能力分析表明,，高脂飲食極大地?fù)p害了血管舒張功能。LXN缺失不僅能逆轉(zhuǎn)高脂飲食引起的血管舒張功能障礙,，還能顯著改善正常小鼠的血管舒張（圖3 A）,，進(jìn)一步表明LXN缺失對(duì)血管的保護(hù)作用。最后,，也是最重要的一點(diǎn),，發(fā)現(xiàn)LXN缺失顯著抑制了高脂飲食誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成（圖3 B、C）,。這些結(jié)果表明,，LXN缺失可以改善小鼠的血管功能，減輕動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成,。

圖3 LXN缺失可改善HF誘導(dǎo)的ApoE-/- 小鼠血管舒張能力和動(dòng)脈粥樣硬化,。

圖4 靜態(tài)和層流剪切應(yīng)力或LXN缺失ECs中細(xì)胞形態(tài)和應(yīng)力纖維網(wǎng)絡(luò)的示意圖。在正常情況下,，正常 ECs中的 Arp2/3,、α-actinin 和 FLNA 交聯(lián)肌動(dòng)蛋白絲產(chǎn)生橫弧,。在層流剪切應(yīng)力下，LXN的丟失導(dǎo)致FLNA的蛋白水解裂解和亞細(xì)胞定位,，ECs中Arp2/3,、α-actinin和paxillin的下調(diào)。結(jié)果表明,，ECs從典型的鵝卵石狀排列拉長(zhǎng)到均勻的紡錘狀排列,，并顯示出F-肌動(dòng)蛋白絲在細(xì)胞縱向上的分布。

綜上所述,，該研究結(jié)果表明,，LXN缺失對(duì)血管具有保護(hù)作用。研究數(shù)據(jù)支持LXN通過(guò)與細(xì)胞骨架蛋白形成復(fù)合物,，成為ECs形態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子,。LXN在血管內(nèi)皮細(xì)胞中直接與FLNA相互作用，這種相互作用是功能性的,，因?yàn)長(zhǎng)XN的缺失增強(qiáng)了FLNA蛋白水解裂解和亞細(xì)胞定位,，它可能是生理性的，因?yàn)樗种屏思?dòng)蛋白絲與黏著斑的錨定,，并導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)變化,，這與層流剪切應(yīng)力對(duì) ECs 的影響相似。重要的是,，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LXN缺失可顯著改善小鼠的血管通透性,、血管舒張和動(dòng)脈粥樣硬化，這表明LXN缺失對(duì)血管穩(wěn)態(tài)具有保護(hù)作用,，為血管疾病的治療提供了新的靶點(diǎn),。

參考文獻(xiàn)：He G, Kan S, Xu S, Sun X, Li R, Shu W, Chen M. LXN deficiency regulates cytoskeleton remodelling by promoting proteolytic cleavage of Filamin A in vascular endothelial cells. J Cell Mol Med. 2021 Jul;25(14):6815-6827. doi: 10.1111/jcmm.16685. Epub 2021 Jun 3. PMID: 34085389; PMCID: PMC8278077.
原文鏈接：pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34085389/

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