近年來，在肌肉生理學(xué)研究中使用體外模型,，可以對細(xì)胞生長和wei;suo的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制進(jìn)行有價值的研究,。盡管藥理學(xué)誘導(dǎo)的生長和wei；suo模型突出了進(jìn)一步研究的關(guān)鍵目標(biāo),，但轉(zhuǎn)化為體內(nèi)人體工作可能有限,。這可能部分是由于基礎(chǔ)培養(yǎng)條件。永生化的骨骼肌細(xì)胞系（如C2C12）常規(guī)使用Dulbecco的改良鷹培養(yǎng)基（DMEM）進(jìn)行培養(yǎng),，并補(bǔ)充有動物源性血清,，即胎牛血清（FBS）用于增殖和馬血清用于分化。盡管這種組合提供了支持細(xì)胞生長的最佳要求,，但這些培養(yǎng)基配方中存在超生理劑量的營養(yǎng)物質(zhì),。因此，傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)模式創(chuàng)造了一個缺乏生理相關(guān)性的微環(huán)境，這使得體外實驗的有效性和任何發(fā)現(xiàn)對人類的適用性受到質(zhì)疑,。

毫無疑問,，有人類參與者的體內(nèi)實驗為研究肌肉生長、wei;suo的機(jī)制和對營養(yǎng)保健品和藥理化合物的潛在健康促進(jìn)反應(yīng)的機(jī)制提供了金標(biāo)準(zhǔn)方法,。然而,，由于倫理考慮和技術(shù)挑戰(zhàn)性，越來越多的人需要開發(fā)一種更生理相關(guān)的體外模型來研究肌肉生長和wei;suo,，這種模型可能更好地轉(zhuǎn)化為人體模型,。此外，這種離體方法允許對某些系統(tǒng)環(huán)境的影響進(jìn)行有價值的研究,，例如衰老,，慢性疾病和營養(yǎng)質(zhì)量，從而為研究受不同隊列和營養(yǎng)刺激影響的分子途徑提供更多的生理基礎(chǔ),。

在英國伯明翰大學(xué)體育,、運動和康復(fù)科學(xué)學(xué)院、威斯敏斯特大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,，愛爾蘭利默里克大學(xué)體育教育和運動科學(xué)系團(tuán)隊的一項新報告中,，概述了目前在體外共培養(yǎng)模型中使用離體人血清和血漿的理解和方法，特別關(guān)注來自永生化細(xì)胞系和原代細(xì)胞培養(yǎng)物（即分別為C2C12和HSMC）的骨骼肌細(xì)胞的使用,，還討論了關(guān)鍵的方falun和未來方向,，以提供該模型的基本原理和潛在應(yīng)用，以實現(xiàn)更廣泛的研究人員使用該方法的標(biāo)準(zhǔn)化,，相關(guān)內(nèi)容發(fā)表在 AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY-CELL PHYSIOLOGY期刊題為“Improving physiological relevance of cell culture: the possibilities, considerations, and future directions of the ex vivo coculture model",。

歷史觀點和當(dāng)前模型進(jìn)展

體外共培養(yǎng)模型的靈感來自于先前建立的異種共生模型。同樣,，體外共培養(yǎng)模型利用離體血清和血漿作為預(yù)處理,，或在培養(yǎng)中wan;quan替代動物血清，以研究對不同系統(tǒng)環(huán)境暴露的反應(yīng),。事實上,，早期利用人血清共培養(yǎng)模型的研究旨在比較不同細(xì)胞類型的增殖和分化能力，如人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）和基質(zhì)細(xì)胞,，在與FBS進(jìn)行比較的情況下,，與人血清培養(yǎng)的反應(yīng)。這些早期研究的首要目的是減少由于批次間差異和異種蛋白的免疫效應(yīng)而在培養(yǎng)中使用的FBS,。調(diào)查這種方法的shou;pi研究之一顯示,，與使用FBS的標(biāo)準(zhǔn)方案相比，與人血清一起孵育的hMSCs的增殖速度加快,。此外,，已經(jīng)確定人血漿和血清之間人成纖維細(xì)胞和脂肪組織來源干細(xì)胞的群體倍增時間沒有差異,，突出了在共培養(yǎng)中除血清外還可利用血漿的潛力。

最近,，離體血漿和血清已被用于骨骼肌細(xì)胞的共培養(yǎng),。這些包括永生化的細(xì)胞系，如C2C12,、L6,、LHCN-M2和HSMC,，以研究細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)對各種治療的反應(yīng),。最早利用肌肉細(xì)胞離體模型的研究之一涉及培養(yǎng)來自年輕和老年供體的HSMC。研究發(fā)現(xiàn),，來自年輕和老年供體的血清在組間用2%人血清處理的HSMC中誘導(dǎo)的增殖和分化沒有變化,。這表明來自不同年齡組的血清可能不會在共培養(yǎng)模型中誘導(dǎo)可檢測到的變化。相比之下,，C2C12骨骼肌細(xì)胞的初步工作提供了更有希望的結(jié)果,。因此，C2C12和LHCN-M2永生化骨骼肌細(xì)胞系聯(lián)合人血清或血漿處理可能為研究細(xì)胞信號傳導(dǎo)提供了合適的替代模型,。近年來,，該模型已擴(kuò)展到研究各種系統(tǒng)環(huán)境的影響，包括損傷,、衰老,、疾病、營養(yǎng)來源和運動,。

肌肉細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型的建立

代謝生理學(xué)中體外共培養(yǎng)模型的發(fā)展在很大程度上是由提高體外研究結(jié)果到體內(nèi)人體試驗的轉(zhuǎn)化的愿望所驅(qū)動的,。因此，需要更多生理性相關(guān)的體外模型來提供一個平臺,，可以試驗新的營養(yǎng)物和藥物治療的有效性,。目前，體外模型已被用于研究飼喂后不同營養(yǎng)源的合成代謝特性,。Carson實驗室的初步工作檢查了離體模型是否可用于檢測C2C12中合成代謝信號的差異,。這些研究強(qiáng)調(diào)了該模型在研究蛋白質(zhì)合成代謝響應(yīng)不同質(zhì)量蛋白質(zhì)的能力，這是由于對替代可持續(xù)蛋白質(zhì)來源的需求不斷增長而取得的重要進(jìn)展,。

除了營養(yǎng)供應(yīng)外,，運動和體育活動還支持肌肉維護(hù)和適應(yīng)性重塑，并可以改善整個生命周期的健康,。盡管運動很重要,，但目前只有一項研究使用永生化的人類骨骼肌細(xì)胞系（LHCN-M2）來調(diào)查不同運動受試者血清的影響。在這項研究中,，從練習(xí)排球,、足球,、游泳或健身至少3年、180分鐘/周的參與者中,，在訓(xùn)練后8-10小時收集血清,，結(jié)果表明，來自運動個體的血清是一種可行的模型,，用于研究運動在培養(yǎng)中的有效性,。然而，需要進(jìn)一步的研究來評估阻力與耐力運動后獲得的血清的影響,，以研究組織重塑的潛在驅(qū)動因素,，例如細(xì)胞外囊泡（EVs）的作用。這可以為研究體外運動提供替代電脈沖刺激（EPS）的模型,。然而,，這種方法將消除機(jī)械刺激的影響，機(jī)械刺激是與體內(nèi)肥大相關(guān)的影響因素,。因此,，更合適的方法可能包括在EPS之前對血清/血漿中的肌肉細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。

總的來說,，體外共培養(yǎng)模型已被用于研究骨骼肌細(xì)胞系和原代骨骼肌細(xì)胞中的不同系統(tǒng)環(huán)境,。盡管許多實驗室已采用人血清或血漿來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基，但目前尚無一致的方法可用于納入離體人血清和/或血漿樣本,，因此這方面的進(jìn)展受到限制,。

肌肉細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型的實際考慮

系統(tǒng)性考慮

在肌肉細(xì)胞的體外共培養(yǎng)模型的發(fā)展中，血漿和血清已被用于研究不同系統(tǒng)環(huán)境的影響（圖1）,。正確使用離體模型需要考慮許多因素,，包括血液成分（即血漿與血清）和劑量的選擇。由于血漿和血清中許多關(guān)鍵化學(xué)分析物（如葡萄糖）的濃度相似,，因此有理由認(rèn)為兩者可以互換用于培養(yǎng),。然而，血漿已被證明會導(dǎo)致活力問題,，可能是凝血因子和纖維蛋白原存在的結(jié)果,。事實上，先前研究表明,，與血清相比,，C2C12s對血漿的耐受性較差，分別為5%和10%-20%,。此外,，用于血漿收集的抗凝劑可能會影響細(xì)胞活力。先前的工作表明,，在鋰肝素（LH）真空容器中收集的離體血漿應(yīng)該是目前離體共培養(yǎng)血漿的標(biāo)準(zhǔn),。

圖1   離體細(xì)胞培養(yǎng)實驗裝置的示意圖,。在正常生長條件下維持的骨骼肌細(xì)胞（細(xì)胞系或原代人細(xì)胞）應(yīng)鋪板進(jìn)行實驗。為了評估肌管中的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo),，在用人血漿/血清治療之前,，應(yīng)讓細(xì)胞分化5-7天。為了評估細(xì)胞增殖和分化的標(biāo)志物,，應(yīng)在進(jìn)行實驗時完成與人血漿/血清的孵育,。

實驗設(shè)置：樣本量、劑量和時間

除了血液成分類型外,，在設(shè)計使用離體模型的實驗時,，還必須考慮樣本量、劑量和治療時間,。根據(jù)先前研究的計算,，建議使用4-6個離體樣本（生物重復(fù)）進(jìn)行實驗,，一式三份,，使用三個連續(xù)的傳代數(shù)來提供技術(shù)重復(fù)。

在增殖或分化過程中,，通常采用合并方法進(jìn)行治療,。先前使用這種方法的研究表明，需要較低劑量的血清才能在較長時間的過程中維持C2C12s或HSMC,，例如分化,，類似于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件（即2%馬血清）。數(shù)據(jù)表明,，需要較低劑量（2%-5%）的人血清來研究整個分化期間誘導(dǎo)的變化,。未來的研究應(yīng)旨在研究在終點治療前的增殖/分化過程中以較低劑量用人血清/血漿共培養(yǎng)細(xì)胞的效用。

根據(jù)實驗?zāi)康?，為了最好地代表體內(nèi)情況,，研究人員可能會尋求zui;da;hua應(yīng)用于培養(yǎng)模型的離體人血漿/血清的劑量。之前曾研究過C2C12細(xì)胞在高濃度離體人血清中的活力,，發(fā)現(xiàn)濃度高達(dá)50% 的C2C12在短時間內(nèi)（2-4小時）耐受性良好,，但較低濃度（高達(dá)20%）耐受性良好長達(dá)24小時?？傮w而言,，這種共培養(yǎng)模型的目的是更接近地模擬細(xì)胞在體內(nèi)暴露的間質(zhì)環(huán)境，并且必須認(rèn)識到血清/血漿不同于間質(zhì)液,。

實驗性對照

除了實驗條件外,，實驗設(shè)置的一個重要組成部分是使用適當(dāng)?shù)膶φ铡Ｓ捎隗w外人血清/血漿的應(yīng)用,，通常需要比較許多不同的條件,，例如,，健康與患病、年輕與老年,、進(jìn)食與禁食,，因此需要許多不同的對照。當(dāng)一起使用時,，這些基線條件可作為重要的對照,，以了解在不同系統(tǒng)環(huán)境孵育后發(fā)現(xiàn)的任何變化是否由于治療效果。

除了使用適當(dāng)?shù)膶φ胀?，還應(yīng)考慮最合適的統(tǒng)計測試,。例如，在調(diào)查疾病或衰老等條件之間的差異時,，應(yīng)選擇組間統(tǒng)計檢驗,。同樣，如果分析中包括血清饑餓或維持在正常生長條件下的未處理對照,，則應(yīng)選擇組間統(tǒng)計檢驗,。相反，如果血清/血漿樣本是在不同時間點從同一參與者獲得的,，例如,，禁食與喂食樣本，或者涉及使用血清/血漿處理,，有或沒有額外的營養(yǎng)供應(yīng)或藥物治療,，則應(yīng)使用統(tǒng)計測試。

基線培養(yǎng)條件

除了考慮使用離體樣本外,，還應(yīng)在整個實驗設(shè)計中考慮基線培養(yǎng)條件,。根據(jù)實驗?zāi)康模囵B(yǎng)細(xì)胞的背景或基礎(chǔ)培養(yǎng)基可能對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響,。例如,，其他研究已經(jīng)顯示，當(dāng)血清被去除時,，C2C12s中的合成代謝信號傳導(dǎo)減少,，之前觀察到在DMEM和血清存在的情況下，將離體人血清添加到C2C12s中反應(yīng)會減弱,。這可能是由于這些培養(yǎng)基中存在高濃度的營養(yǎng)物質(zhì)（即EAA）和生長因子,，從而導(dǎo)致飽和效應(yīng)。其他營養(yǎng)因素,，如高或低葡萄糖,，應(yīng)根據(jù)實驗?zāi)康目紤]。

非肌肉細(xì)胞系的注意事項

以上主要考慮了該方案在使用肌肉細(xì)胞系時提高生理學(xué)相關(guān)性的發(fā)展,。然而,，除了血腦屏障內(nèi)的細(xì)胞,，比如用運動前后的血漿刺激癌細(xì)胞的增殖外，這種方法不能用于大多數(shù)非肌肉細(xì)胞系的原因幾乎沒有,。值得注意的是,，離體共培養(yǎng)模型已經(jīng)應(yīng)用于許多非肌肉細(xì)胞系，如脂肪細(xì)胞,、肝細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞,。

未來發(fā)展方向和新應(yīng)用

正如以上所述，體外模型有潛力研究細(xì)胞內(nèi)機(jī)制對多種刺激的反應(yīng),，包括不同的疾病狀態(tài)和營養(yǎng)狀況,。當(dāng)HSMC不可用時，這可能特別重要,，并在具有技術(shù)挑戰(zhàn)性的體內(nèi)試驗之前提供有價值的見解（圖2）,。然而，未來的工作應(yīng)旨在研究HSMC與C2C12骨骼肌細(xì)胞的離體血清/血漿響應(yīng)信號傳導(dǎo)是否存在差異,，以消除任何潛在的“跨物種"影響并解釋潛在的內(nèi)在肌肉特性,。此外，值得注意的是,，該模型不僅限于使用人血清或血漿,。最后,，隨著EVs在細(xì)胞通信中的新興作用,，包括肌肉對運動等刺激的反應(yīng)，以及觀察到FBS含有直接抑制C2C12分化的功能性EVs,，未來的一個研究方向可能是EVs耗盡血漿/血清以及提取和重懸的EVs,。

圖2   體外和體內(nèi)工作的推薦操作模型。建議體外模型應(yīng)利用人原代骨骼肌細(xì)胞或永生化細(xì)胞系,，例如C2C12s,，協(xié)同人血清/血漿處理。體外研究的結(jié)果可用于為體內(nèi)人體分析提供信息,。在人類數(shù)據(jù)收集后,，可以進(jìn)行進(jìn)一步的體外工作，以探索進(jìn)一步的機(jī)制數(shù)據(jù)以及營養(yǎng)物質(zhì)和藥物治療的有效性,，以根據(jù)初步發(fā)現(xiàn)為以后的體內(nèi)工作提供信息,。

圖3  圖形概要

參考文獻(xiàn)：Allen SL, Elliott BT, Carson BP, Breen L. Improving physiological relevance of cell culture: the possibilities, considerations, and future directions of the ex vivo coculture model. Am J Physiol Cell Physiol. 2023 Feb 1;324(2):C420-C427. doi: 10.1152/ajpcell.00473.2022. Epub 2022 Dec 26. PMID: 36571441; PMCID: PMC9902212.

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