肝臟是人體最大的消化腺，負(fù)責(zé)合成,、代謝,、分解,、解毒等500多種功能。它主要由肝細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞組成,，如肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（LSECs）,、肝星狀細(xì)胞（HSCs）和Kupffer細(xì)胞（KCs），它們通過(guò)直接或間接的細(xì)胞串?dāng)_事件共同調(diào)節(jié)肝功能,。

體外肝臟模型,，包括2D和3D肝細(xì)胞單一培養(yǎng)和共培養(yǎng)模型，在成本,、倫理考慮和效率方面比動(dòng)物模型具有優(yōu)勢(shì),。然而，2D肝細(xì)胞模型缺乏生理相關(guān)性,，而3D肝細(xì)胞單一培養(yǎng)模型無(wú)法代表實(shí)質(zhì)和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞之間的復(fù)雜相互作用。因此,，模擬天然肝組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞相互作用的3D共培養(yǎng)肝臟模型的開(kāi)發(fā)為更準(zhǔn)確地體外預(yù)測(cè)人類(lèi)藥物反應(yīng)敏感性提供了潛力,。以前常用的預(yù)測(cè)工具往往無(wú)法可靠地預(yù)測(cè)藥物在人體中的療效和毒性，導(dǎo)致藥物開(kāi)發(fā)中的高損耗率,。3D細(xì)胞共培養(yǎng)肝臟模型可以更好地預(yù)測(cè)人類(lèi)藥物反應(yīng),，并已在許多研究中用于預(yù)測(cè)候選或上市藥物的體內(nèi)代謝和清除。

在遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,、英國(guó)癌癥研究中心曼徹斯特研究所的一項(xiàng)聯(lián)合研究中,，在討論肝臟原代實(shí)質(zhì)和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的du;te結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)上，分析了3D細(xì)胞共培養(yǎng)肝臟模型在藥物研究中的潛在優(yōu)勢(shì),；然后介紹了3D細(xì)胞共培養(yǎng)肝臟模型中肝細(xì)胞的主要來(lái)源以及構(gòu)建3D細(xì)胞共培養(yǎng)肝臟模型的常用方法,；最后討論了具有不同功能的3D細(xì)胞共培養(yǎng)肝臟系統(tǒng)及其應(yīng)用。

肝臟的主要細(xì)胞成分及其功能

具有六邊形結(jié)構(gòu)的肝小葉構(gòu)成了肝臟的基本結(jié)構(gòu)和功能單位（圖1）,。中央靜脈貫穿每個(gè)小葉的中心,，負(fù)責(zé)運(yùn)輸肝內(nèi)代謝物。小葉周?chē)情T(mén)靜脈三聯(lián)體,，由肝門(mén)靜脈,、肝動(dòng)脈和膽管組成。肝門(mén)靜脈將營(yíng)養(yǎng)豐富的血液輸送到肝臟,，而肝動(dòng)脈則向肝臟供氧,。

肝細(xì)胞是肝臟中zui;fen;fu的細(xì)胞類(lèi)型，它們形成從中央靜脈向外輻射的肝細(xì)胞板,。相鄰的肝板之間所形成的腔隙,，就是肝臟非常重要的生理解剖結(jié)構(gòu)，即肝血竇,。膽小管由兩個(gè)鄰近的肝細(xì)胞之間的間隙所形成,，能夠分泌、輸送膽汁。肝小葉的結(jié)構(gòu)和功能是由各種肝細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用所調(diào)節(jié)的,。

圖1   肝小葉結(jié)構(gòu)示意圖,。

3D細(xì)胞共培養(yǎng)肝臟模型在藥物評(píng)估中的潛在優(yōu)勢(shì)

3D系統(tǒng)可以是自聚集的細(xì)胞球體，由天然或合成材料制成的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）樣3D網(wǎng)絡(luò)支架,，以及使用3D技術(shù)構(gòu)建的器官樣系統(tǒng),，其具有氧氣，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和各種生物因子梯度和3D組織結(jié)構(gòu),，可以發(fā)生細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-ECM相互作用,。這種培養(yǎng)模式更接近體內(nèi)復(fù)雜的微環(huán)境，在很大程度上有助于改善體外肝細(xì)胞的功能活性,。

然而,，人們逐漸意識(shí)到，3D肝細(xì)胞單一培養(yǎng)模型忽略了肝組織中異型細(xì)胞的直接或間接信號(hào)交換,。因此,，整合肝異型細(xì)胞相互作用和3D微環(huán)境信號(hào)傳導(dǎo)的3D共培養(yǎng)肝臟模型脫穎而出，具有許多優(yōu)點(diǎn),。多項(xiàng)研究表明,，在藥物誘導(dǎo)的肝毒性、肝藥物代謝和藥物相互作用研究中,，3D 細(xì)胞共培養(yǎng)肝臟模型比 2D 和 3D 單培養(yǎng)和 2D 共培養(yǎng)表現(xiàn)出更好的預(yù)測(cè)能力,，因?yàn)?3D 細(xì)胞共培養(yǎng)中的細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境和異型細(xì)胞之間的信號(hào)調(diào)控使它們?cè)隗w內(nèi)表現(xiàn)出更相關(guān)的肝臟環(huán)境和表型，如可復(fù)制的肝竇結(jié)構(gòu),、肝細(xì)胞活性和功能的長(zhǎng)期維持,、以及與肝臟特異性功能相關(guān)的基因表達(dá)的增加。Al Hrout等人構(gòu)建的肝癌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的3D共培養(yǎng)模型,，與肝癌細(xì)胞的2D或3D單培養(yǎng)相比,，肝癌細(xì)胞發(fā)展相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)增加，預(yù)后較差,，且更接近肝癌在體內(nèi)的發(fā)育特征,，有助于更準(zhǔn)確地評(píng)估體外抗癌藥物的抗癌作用?？傊?，3D細(xì)胞共培養(yǎng)肝臟模型可有效提高肝細(xì)胞體外功能穩(wěn)定性，保證體外藥物預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性,，有望為藥物研究提供可靠的新平臺(tái),。

3D細(xì)胞共培養(yǎng)肝臟模型的肝細(xì)胞來(lái)源

1. 原代肝細(xì)胞

原代肝細(xì)胞（PHs）被廣泛認(rèn)為是構(gòu)建體外肝臟模型的金標(biāo)準(zhǔn)，動(dòng)物和人源肝細(xì)胞都被使用,。特別是原代人肝細(xì)胞（PHHs）,，由于其分泌特性和代謝酶活性與體內(nèi)肝細(xì)胞相當(dāng),，能夠可靠地反映體內(nèi)肝臟特性，因此在藥物相互作用,、藥物代謝和藥物毒性研究中受到研究人員的青睞,。然而，其功能特性的穩(wěn)定表達(dá)高度依賴(lài)于微環(huán)境的信號(hào)調(diào)控,，這意味著PHHs在單一的2D環(huán)境下會(huì)迅速經(jīng)歷表型變化,、細(xì)胞活性下降和細(xì)胞膜極性喪失。為了增強(qiáng)PHHs的功能活性,，有研究分別利用由Matrigel和3D生物打印模型組成的3D培養(yǎng)環(huán)境對(duì)PHHs的體外培養(yǎng)條件進(jìn)行了改進(jìn),。這些研究表明，PHHs可以維持其形態(tài)和功能數(shù)月,，并改善對(duì)肝毒性藥物的敏感性,。

2. 肝癌細(xì)胞系

HepaRG、HepG2,、Huh7和Hep3B是用于構(gòu)建體外肝臟模型的常見(jiàn)肝細(xì)胞癌來(lái)源細(xì)胞系,，因?yàn)樗鼈円子讷@得、易于培養(yǎng),、增殖性高且表型穩(wěn)定，與PHHs相比,，供體間變異性較小,。然而，這些細(xì)胞系的高增殖潛力通常伴隨著低分化表型,，這導(dǎo)致缺乏特定的肝功能,，特別是在酶表達(dá)水平（特別是參與藥物代謝的I期和II期代謝酶）、蛋白質(zhì)和尿素合成方面,，以及對(duì)毒性反應(yīng)的敏感性遠(yuǎn)低于PHHs,。

3. 干細(xì)胞

人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（HiPSCs）、胚胎干細(xì)胞（ESCs）和成體干細(xì)胞（ASCs）,，如間充質(zhì)干細(xì)胞,、肝臟干細(xì)胞和造血干細(xì)胞，在體外表現(xiàn)出強(qiáng)大的自我復(fù)制和自我更新能力,。特別是HiPSCs和ESCs,，在某些條件下具有分化成人體中幾乎任何細(xì)胞類(lèi)型的潛力。此外,，HiPSCs可以從患者活檢中獲得,，用于個(gè)性化研究。在全球肝臟供體稀缺的背景下,，在特定條件下能夠分化成肝細(xì)胞樣細(xì)胞的干細(xì)胞可以作為肝病治療,，再生和體外建模的潛在資源.然而,，干細(xì)胞在體外很難分化成功能成熟的肝細(xì)胞，并且可能存在免疫排斥和資源短缺等挑戰(zhàn),。

3D細(xì)胞共培養(yǎng)肝臟模型的常用共培養(yǎng)方法

1. 直接 3D 共培養(yǎng)

直接3D共培養(yǎng)涉及將兩種或多種不同類(lèi)型的肝細(xì)胞混合成自組裝球體,，或在模擬天然肝組織結(jié)構(gòu)的3D環(huán)境中將它們一起培養(yǎng)（圖2）。直接 3D 共培養(yǎng)允許不同肝細(xì)胞之間的密切接觸,，從而通過(guò)直接細(xì)胞-細(xì)胞粘附,、可溶性細(xì)胞因子的旁分泌、細(xì)胞-ECM 粘附和其他機(jī)制實(shí)現(xiàn)它們之間的信號(hào)通信,。在像肝臟這樣的多細(xì)胞器官中,，異型細(xì)胞之間的直接接觸在肝功能的充分發(fā)揮中起著重要作用。然而,，在決定直接共培養(yǎng)的合理性時(shí),，重要的是要考慮體內(nèi)肝組織中共培養(yǎng)細(xì)胞的實(shí)際分布。在體內(nèi)通常沒(méi)有直接接觸的細(xì)胞類(lèi)型的體外直接接觸共培養(yǎng)可能是不必要的,。此外,，異型細(xì)胞之間的緊密連接也會(huì)影響細(xì)胞分離的難度，這對(duì)于需要單細(xì)胞類(lèi)型分析的實(shí)驗(yàn)可能是不利的,。因此,，使用直接共培養(yǎng)的決定應(yīng)基于共培養(yǎng)細(xì)胞的類(lèi)型和實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/span>

圖2   直接3D細(xì)胞共培養(yǎng)肝臟模型的示例。
（A）混合細(xì)胞球狀共培養(yǎng)系統(tǒng),。（二）3D支架共培養(yǎng),。

2. 間接 3D 共培養(yǎng)

間接 3D 共培養(yǎng)涉及在具有物理分離系統(tǒng)的3D環(huán)境中培養(yǎng)兩種或兩種以上類(lèi)型的肝細(xì)胞（圖3），不允許存在于物理分離系統(tǒng)兩側(cè)的細(xì)胞之間直接接觸,，它們之間的信號(hào)通過(guò)可溶性細(xì)胞因子進(jìn)行通信,。物理分離系統(tǒng)的常見(jiàn)材料是Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板和各種天然或合成材料。此外,，一些研究人員還利用3D生物打印技術(shù)實(shí)現(xiàn)了HepG2和NIH/3T3成纖維細(xì)胞的間接3D共培養(yǎng),。他們證明，與HepG2的單培養(yǎng)相比,，HepG2和NIH/3T3成纖維細(xì)胞的共培養(yǎng)表現(xiàn)出更好的肝細(xì)胞功能,。間接共培養(yǎng)系統(tǒng)可以有效避免不必要的細(xì)胞接觸，促進(jìn)共培養(yǎng)異型細(xì)胞的分離,，并可能成為研究體內(nèi)非接觸性肝細(xì)胞通訊的有前途的工具,。

圖3   間接3D細(xì)胞共培養(yǎng)肝臟模型的示例。

3D細(xì)胞共培養(yǎng)肝臟模型的類(lèi)型

1. 增強(qiáng)肝細(xì)胞功能的3D細(xì)胞共培養(yǎng)模型

在肝組織中,，肝細(xì)胞被LSECs 形成的肝竇網(wǎng)絡(luò)包圍,，作為肝細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)交換的基礎(chǔ)，對(duì)維持肝細(xì)胞活性和功能穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要,。LSECs和肝細(xì)胞的體外共培養(yǎng)已被證明能夠?qū)崿F(xiàn)血管化的3D肝組織結(jié)構(gòu),，其中血管樣管狀網(wǎng)絡(luò)的存在提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣,，以支持體外肝細(xì)胞的功能并維持代謝廢物的消除。此外,，LSECs可通過(guò)Id1通路誘導(dǎo)血管分泌因子Wnt2和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）上調(diào),，這兩者都對(duì)肝細(xì)胞增殖至關(guān)重要?？傊?，在3D環(huán)境下，LSECs與肝細(xì)胞共培養(yǎng)可以重現(xiàn)體內(nèi)肝竇的關(guān)鍵結(jié)構(gòu),，這對(duì)體外增強(qiáng)肝細(xì)胞功能的研究具有重要意義,。

2. 肝纖維化的3D細(xì)胞共培養(yǎng)模型

肝纖維化是一種肝臟疾病，其特征是肝臟中積累過(guò)多的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,。近年來(lái)開(kāi)發(fā)了一系列與體內(nèi)相關(guān)的3D細(xì)胞共培養(yǎng)肝纖維模型,。體內(nèi)肝纖維化受多種肝細(xì)胞調(diào)節(jié)，包括HSCs,、肝細(xì)胞,、LSECs 和KCs。然而,，目前肝纖維化的共培養(yǎng)模型有限,，只有少數(shù)研究報(bào)告了LSECs與HSCs、肝細(xì)胞和/或KCs的共培養(yǎng),，以建立肝纖維化的體外模型,。因此，未來(lái)的研究必須將不同類(lèi)型的肝細(xì)胞整合到3D環(huán)境中進(jìn)行共培養(yǎng),，以構(gòu)建更具代表性的肝纖維化體外模型。

3. 藥物性肝損傷的3D細(xì)胞共培養(yǎng)模型

肝細(xì)胞由于其du;te的功能活性,，通常被用作藥物篩選模型的金標(biāo)準(zhǔn),。然而，KCs作為肝臟駐留巨噬細(xì)胞群的作用不容忽視,，特別是在免疫介導(dǎo)的藥物誘導(dǎo)性肝損傷中,，因?yàn)樗鼈兙哂杏行У那宄屯淌晒δ堋Cs在肝毒性反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用,，包含肝細(xì)胞和KCs的3D共培養(yǎng)系統(tǒng)有可能為未來(lái)臨床前藥物誘導(dǎo)的肝毒性評(píng)估提供更準(zhǔn)確和有效的工具,。然而，需要更多的研究來(lái)確認(rèn)這些共培養(yǎng)系統(tǒng)在毒性藥物篩選中的一般應(yīng)用的功能特性,。

總之,，具有更復(fù)雜的細(xì)胞通訊和微環(huán)境特征的3D細(xì)胞共培養(yǎng)肝臟模型將成為未來(lái)藥物開(kāi)發(fā)和篩選研究的有力工具，提高體外藥物評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)的可靠性,。解決肝細(xì)胞體外培養(yǎng)條件的挑戰(zhàn)并進(jìn)一步開(kāi)發(fā)肝臟ECM樣細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和微流控芯片是朝著這個(gè)方向邁出的重要一步,。

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