腰痛（LBP）影響健康的常見疾病之一,，終生患病率接近80%,。小關(guān)節(jié)退變（Facet joint degeneration）約占慢性LBP的30%,。脊柱小關(guān)節(jié)即關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)，位于脊柱的兩側(cè),，由上關(guān)節(jié)突和下關(guān)節(jié)突組成,。生物力學(xué)結(jié)構(gòu)的改變和合成代謝的紊亂最終導(dǎo)致小關(guān)節(jié)退變，其特征是軟骨變薄,、軟骨下骨硬化和關(guān)節(jié)間隙變窄,。近年來，雙足站立模型已被gong;ren為研究小關(guān)節(jié)退變的理想工具,。小鼠站立10周后,，小關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯退變，國際骨關(guān)節(jié)炎研究學(xué)會（OARSI）評分等級和基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP13）升高,，而膠原蛋白II降低,。

細(xì)胞衰老是一種以細(xì)胞周期停滯為特征的穩(wěn)定狀態(tài)。衰老細(xì)胞高度表達(dá)P53,、P21,、P16和衰老相關(guān)-β-半乳糖苷酶（SA-β-gal），可以釋放衰老相關(guān)的分泌表型（SASP）,，包括炎性細(xì)胞因子,、趨化因子、生長因子和蛋白酶,，以影響周圍細(xì)胞,。在關(guān)節(jié)退變中，衰老細(xì)胞的存在加劇了關(guān)節(jié)軟骨的破壞,，而抑制細(xì)胞衰老可改善軟骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)并緩解骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展,。據(jù)報道，在膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎中,，機械超負(fù)荷可下調(diào)F-box和WD重復(fù)結(jié)構(gòu)域7（FBXW7）泛素連接酶的表達(dá)并激活JNK通路,，從而促進(jìn)軟骨細(xì)胞衰老。另一項研究報道,，機械超負(fù)荷誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎伴有軟骨細(xì)胞衰老,，而尿石素A可通過恢復(fù)線粒體穩(wěn)態(tài)來減少軟骨細(xì)胞衰老，從而緩解骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展,。然而,，機械超負(fù)荷是否引起腰椎小關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞衰老以及具體機制如何尚未報道。

MicroRNAs是一系列長度為21-23nt的非編碼RNA,，通過沉默或降解mRNA分子調(diào)控基因表達(dá)。MicroRNAs廣泛參與軟骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和骨關(guān)節(jié)炎,。小關(guān)節(jié)退變伴有microRNA表達(dá)的改變,。使用反義寡核苷酸抑制miR-181a-5p可減輕小關(guān)節(jié)軟骨退變的嚴(yán)重程度,。包括microRNAs在內(nèi)的非編碼RNAs在軟骨細(xì)胞衰老中起重要作用。據(jù)報道,，MiR-29b-5p可緩解軟骨細(xì)胞衰老,，p21和p16表達(dá)降低。然而,，機械超負(fù)荷是否通過microRNAs調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞衰老仍然未知,。

在湖南省中南大學(xué)湘雅醫(yī)院脊柱外科、器官損傷衰老與再生醫(yī)學(xué)湖南省重點實驗室等研究團(tuán)隊一項研究中,，證明了機械超負(fù)荷誘導(dǎo)的miR-325-3p降低可以通過增加trp53表達(dá)來促進(jìn)軟骨細(xì)胞衰老,。利用AAV上調(diào)miR-325-3p表達(dá)可有效減輕軟骨細(xì)胞衰老，緩解小關(guān)節(jié)退變的進(jìn)展,，為小關(guān)節(jié)退變提供潛在的治療方法,。

人和小鼠小關(guān)節(jié)退變伴有軟骨細(xì)胞衰老

實驗首先探究了退變對軟骨衰老的影響。從患者手術(shù)中獲得小關(guān)節(jié)軟骨,，HE染色顯示,，退變的FJ軟骨變薄，膠原蛋白成分減少（圖1 A）,。 Safranin O還表明,，退變FJs的軟骨細(xì)胞大大減少（圖1 B）。與正常關(guān)節(jié)相比,，退變關(guān)節(jié)的OARSI評分升高（圖1 C）,。與正常組織相比，退變FJ的P53陽性或P21陽性軟骨細(xì)胞增加（圖1 D-G）,。

然后進(jìn)一步研究了小鼠退變FJ中是否也存在細(xì)胞衰老,，使用雙足站立模型誘導(dǎo)小鼠FJ退變，這顯著增加了脊柱軸向應(yīng)力,。結(jié)果發(fā)現(xiàn),，小鼠兩側(cè)的小關(guān)節(jié)退變沒有顯著差異。與對照組相比,，站立10周后,，關(guān)節(jié)軟骨變薄，軟骨細(xì)胞減少,，OARSI評分升高（圖1 H-J）,。免疫組化（IHC）染色還表明，站立10周后,，小鼠P53和P21陽性細(xì)胞明顯增加（圖1 K-N）,。這些結(jié)果表明，F(xiàn)J退變表現(xiàn)出骨關(guān)節(jié)炎的特征，伴有軟骨細(xì)胞衰老,。

圖1   軟骨細(xì)胞衰老與人類和小鼠的腰椎小關(guān)節(jié)（FJ）退變有關(guān),。

體外機械超負(fù)荷誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞衰老和SASP釋放

為了探索體外機械負(fù)荷是否會影響軟骨細(xì)胞衰老，分離了原代軟骨細(xì)胞,，在0.5 Hz的頻率下,，用5%和20%的拉伸應(yīng)力加載0h、6h,、12h和24h,。在5%的拉伸應(yīng)力下，處理6 h后膠原蛋白II含量差異不顯著,，12h和24h后其含量增加,。在20%的拉伸應(yīng)力下，膠原蛋白II含量逐漸降低（圖2 A,、B）,。Col2a1的qRT-PCR顯示出類似的趨勢（圖2 C）。在5%的拉伸應(yīng)力下,，MMP13表達(dá)逐漸降低,，而在20%拉伸應(yīng)力下呈時間依賴性逐漸升高（圖2 D）。

然后進(jìn)一步對SA-β-gal和P21 進(jìn)行染色,，以評估機械應(yīng)力對軟骨細(xì)胞衰老的影響,。在5%拉伸應(yīng)力下，SA-β-gal陽性細(xì)胞的比例無統(tǒng)計學(xué)差異,。在20%拉伸應(yīng)力下,，SA-β-gal陽性細(xì)胞的數(shù)量隨刺激時間的延長而增加（圖2 E、G）,。P21（紅色）的免疫熒光染色顯示出類似的趨勢（圖2 F,、H）。qRT-PCR結(jié)果顯示,，在20% 拉伸應(yīng)力作用24h后,，PAI-1、IL-6和TGF-β等SASP因子顯著升高（圖2 I）,。這些結(jié)果表明,，適當(dāng)?shù)臋C械應(yīng)力有利于軟骨細(xì)胞的合成代謝，并且不會導(dǎo)致軟骨細(xì)胞衰老,。然而,，過度的機械應(yīng)力不利于細(xì)胞合成代謝并導(dǎo)致軟骨細(xì)胞衰老。

圖2   體外過度的機械負(fù)荷誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞衰老,。

過度機械應(yīng)力下軟骨細(xì)胞中MiR-325-3p下調(diào)

為了探索機械超負(fù)荷誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞衰老的機制,，通過篩選關(guān)節(jié)退變和骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的microRNAs進(jìn)行了microRNA陣列分析,。結(jié)果顯示，在這些microRNAs中,，miR-325-3p的降低最為顯著,。接下來檢測了小鼠腰椎小關(guān)節(jié)中的miR-325-3p表達(dá)。結(jié)果顯示,，miR-325-3p主要在軟骨層表達(dá)，與對照組相比,，站立10周后明顯下調(diào),。這些結(jié)果表明，機械過載降低了miR-325-3p在體內(nèi)和體外的表達(dá),。

體外MiR-325-3p過表達(dá)挽救機械超負(fù)荷誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞衰老

為了研究miR-325-3p在機械超負(fù)荷誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞衰老中的作用,，構(gòu)建了miR-325-3p模擬物和抑制劑。在沒有拉伸應(yīng)力下,，miR-325-3p抑制劑降低了膠原蛋白II的表達(dá),，衰老軟骨細(xì)胞（SA-β-gal和P21陽性細(xì)胞）的數(shù)量增加，衰老相關(guān)基因P21,、P16,、P53和SASP因子PAI-1、IL-6和TGF-β上調(diào),。

然后,，在20%的拉伸應(yīng)力下施用miR-325-3p模擬物，以確認(rèn)miR-325-3p對軟骨細(xì)胞衰老的影響,。在機械過載下,，miR-325-3p模擬物顯著增加膠原II表達(dá)。在20%拉伸應(yīng)力處理24h后,，miR-325-3p模擬物可以減少衰老軟骨細(xì)胞（SA-β-gal陽性細(xì)胞和p21陽性細(xì)胞）的數(shù)量,，明顯降低了衰老相關(guān)基因P21、P16,、P53和SASP因子PAI-1,、IL-6和TGF-β的表達(dá)。這些結(jié)果表明,，miR-325-3p可以挽救機械超負(fù)荷誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷和衰老,。

小鼠雙足站立模型中表達(dá)AAV的miR-325-3p減輕機械超負(fù)荷誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞衰老和FJ退變

為了探究miR-325-3p對體內(nèi)軟骨細(xì)胞衰老和FJ退變的影響，構(gòu)建了表達(dá)miR-325-3p的腺相關(guān)病毒（AAV）,。AAV-miR-325-3p促進(jìn)了軟骨細(xì)胞中miR-325-3p的表達(dá)（圖3 A,、B）。HE和safranin O染色表明,，AAV-miR-325-3p增加了軟骨厚度和軟骨細(xì)胞數(shù)量（圖3 C）,。在給予AAV-miR-325-3p后，OARSI評分也升高（圖3 D）。

為了評估AAV-miR-325-3p對軟骨細(xì)胞衰老的影響,，進(jìn)行了p53和p21的IHC,。與對照組相比，接受AAV-NC的實驗小鼠p53和p21陽性細(xì)胞數(shù)量增加,，而關(guān)節(jié)內(nèi)注射AAV-miR-325-3p時衰老軟骨細(xì)胞減少（圖3 E-H）,。IHC染色顯示，AAV-miR-13-325p處理后,，膠原蛋白II陽性和蛋白聚糖陽性軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯升高,，而MMP 13陽性細(xì)胞減少。這些結(jié)果表明,，表達(dá)miR-325-3p的AAV可以有效延緩軟骨細(xì)胞衰老,，減輕機械超負(fù)荷引起的FJ退變。

圖3   AAV-miR-325-3p OE（過表達(dá)）緩解站立模型小鼠腰椎小關(guān)節(jié)軟骨衰老,。

MiR-325-3p 通過靶向 trp53 減輕軟骨細(xì)胞衰老

實驗最后進(jìn)一步探討了miR-325-3p調(diào)控軟骨細(xì)胞衰老的機制,。通過預(yù)測miR-325-3p的下游靶基因和與衰老相關(guān)的GO通路相交，發(fā)現(xiàn)了5個潛在基因（Trp53,，TBX,，SRF，Trp63,，P21）（圖4 A）,。隨后，通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn),，用miR-325-3p模擬物處理后,，軟骨細(xì)胞中Trp53和P21表達(dá)明顯降低，而TBX,、SRF和Trp63的表達(dá)沒有差異（圖4 B）,。然后驗證了miR-325-3p和Trp53之間的結(jié)合關(guān)系。Trp53的3′UTR具有與miR-325-3p互補的序列（圖4 C）,。雙熒光素酶報告基因測定的結(jié)果表明,，當(dāng)用野生型Trp53質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293個T細(xì)胞時，miR-325-3p模擬物降低了熒光素酶活性,。當(dāng)273個T細(xì)胞用突變體Trp53質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時,，未觀察到任何變化，表明miR-325-3p可以直接靶向Trp53（圖4 D）,。

為了進(jìn)一步探討miR-325-3p是否通過調(diào)控Trp53抑制軟骨細(xì)胞衰老,，使用了濃度為0.5 μM的p53激活劑NSC-207895。首先探討了miR-325-3p模擬物處理后NSC-207895對機械應(yīng)力下軟骨細(xì)胞的影響,。結(jié)果發(fā)現(xiàn),，NSC-207895可以逆轉(zhuǎn)miR-325-3p在機械過載下對軟骨細(xì)胞的促進(jìn)合成代謝作用,。然后，SA-β-gal染色和P21（紅色）染色顯示,，miR-325-3p減輕機械過載誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞衰老,，SA-β-gal陽性細(xì)胞和p21陽性細(xì)胞減少，但當(dāng)用NSC-207895處理時,，這種效果減弱（圖4 E-G）,。此外，NSC-207895在mRNA和蛋白質(zhì)水平上分別降低了miR-325-3p模擬物下調(diào)P16,、P21和P53表達(dá)的作用（圖4 H-J）,。同時，miR-325-3p降低了SASP因子PAI-1,、IL-6和TGF-β的表達(dá)，然而,，NSC-207895 減弱了這種效果（圖4 H）,。這些結(jié)果表明，miR-325-3p通過抑制Trp53表達(dá)來減輕軟骨細(xì)胞衰老和SASP釋放,。

圖4   靶向P53的miR-325-3p和NSC-207895 在體外逆轉(zhuǎn)miR-325-3p抑制機械應(yīng)力誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老的作用,。

總之，該研究表明,，miR-325-3p通過激活p53/p21通路來減少軟骨細(xì)胞衰老并減輕機械過載誘導(dǎo)的脊柱小關(guān)節(jié)退變,，這可能為延緩脊柱小關(guān)節(jié)退變進(jìn)展提供潛在的治療策略。

參考文獻(xiàn)：Zhao J, Li C, Qin T, Jin Y, He R, Sun Y, Liu Z, Wu T, Duan C, Cao Y, Hu J. Mechanical overloading-induced miR-325-3p reduction promoted chondrocyte senescence and exacerbated facet joint degeneration. Arthritis Res Ther. 2023 Apr 4;25(1):54. doi: 10.1186/s13075-023-03037-3. PMID: 37016437; PMCID: PMC10071751.

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