腰痛（LBP）影響健康的常見(jiàn)疾病之一,，終生患病率接近80%,。小關(guān)節(jié)退變（Facet joint degeneration）約占慢性LBP的30%,。脊柱小關(guān)節(jié)即關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)，位于脊柱的兩側(cè),，由上關(guān)節(jié)突和下關(guān)節(jié)突組成,。生物力學(xué)結(jié)構(gòu)的改變和合成代謝的紊亂最終導(dǎo)致小關(guān)節(jié)退變,，其特征是軟骨變薄、軟骨下骨硬化和關(guān)節(jié)間隙變窄,。近年來(lái),，雙足站立模型已被gong;ren為研究小關(guān)節(jié)退變的理想工具。小鼠站立10周后,，小關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯退變,，國(guó)際骨關(guān)節(jié)炎研究學(xué)會(huì)（OARSI）評(píng)分等級(jí)和基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP13）升高，而膠原蛋白II降低,。

細(xì)胞衰老是一種以細(xì)胞周期停滯為特征的穩(wěn)定狀態(tài),。衰老細(xì)胞高度表達(dá)P53、P21,、P16和衰老相關(guān)-β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）,，可以釋放衰老相關(guān)的分泌表型（SASP），包括炎性細(xì)胞因子,、趨化因子,、生長(zhǎng)因子和蛋白酶，以影響周?chē)?xì)胞,。在關(guān)節(jié)退變中,，衰老細(xì)胞的存在加劇了關(guān)節(jié)軟骨的破壞，而抑制細(xì)胞衰老可改善軟骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)并緩解骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展,。據(jù)報(bào)道,，在膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎中，機(jī)械超負(fù)荷可下調(diào)F-box和WD重復(fù)結(jié)構(gòu)域7（FBXW7）泛素連接酶的表達(dá)并激活JNK通路,，從而促進(jìn)軟骨細(xì)胞衰老,。另一項(xiàng)研究報(bào)道，機(jī)械超負(fù)荷誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎伴有軟骨細(xì)胞衰老,，而尿石素A可通過(guò)恢復(fù)線粒體穩(wěn)態(tài)來(lái)減少軟骨細(xì)胞衰老,，從而緩解骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。然而,，機(jī)械超負(fù)荷是否引起腰椎小關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞衰老以及具體機(jī)制如何尚未報(bào)道,。

MicroRNAs是一系列長(zhǎng)度為21-23nt的非編碼RNA，通過(guò)沉默或降解mRNA分子調(diào)控基因表達(dá),。MicroRNAs廣泛參與軟骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和骨關(guān)節(jié)炎,。小關(guān)節(jié)退變伴有microRNA表達(dá)的改變。使用反義寡核苷酸抑制miR-181a-5p可減輕小關(guān)節(jié)軟骨退變的嚴(yán)重程度,。包括microRNAs在內(nèi)的非編碼RNAs在軟骨細(xì)胞衰老中起重要作用,。據(jù)報(bào)道，MiR-29b-5p可緩解軟骨細(xì)胞衰老,，p21和p16表達(dá)降低,。然而,，機(jī)械超負(fù)荷是否通過(guò)microRNAs調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞衰老仍然未知。

在湖南省中南大學(xué)湘雅醫(yī)院脊柱外科,、器官損傷衰老與再生醫(yī)學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室等研究團(tuán)隊(duì)一項(xiàng)研究中，證明了機(jī)械超負(fù)荷誘導(dǎo)的miR-325-3p降低可以通過(guò)增加trp53表達(dá)來(lái)促進(jìn)軟骨細(xì)胞衰老,。利用AAV上調(diào)miR-325-3p表達(dá)可有效減輕軟骨細(xì)胞衰老,，緩解小關(guān)節(jié)退變的進(jìn)展，為小關(guān)節(jié)退變提供潛在的治療方法,。

人和小鼠小關(guān)節(jié)退變伴有軟骨細(xì)胞衰老

實(shí)驗(yàn)首先探究了退變對(duì)軟骨衰老的影響,。從患者手術(shù)中獲得小關(guān)節(jié)軟骨，HE染色顯示,，退變的FJ軟骨變薄,，膠原蛋白成分減少（圖1 A）。 Safranin O還表明,，退變FJs的軟骨細(xì)胞大大減少（圖1 B）,。與正常關(guān)節(jié)相比，退變關(guān)節(jié)的OARSI評(píng)分升高（圖1 C）,。與正常組織相比,，退變FJ的P53陽(yáng)性或P21陽(yáng)性軟骨細(xì)胞增加（圖1 D-G）。

然后進(jìn)一步研究了小鼠退變FJ中是否也存在細(xì)胞衰老,，使用雙足站立模型誘導(dǎo)小鼠FJ退變,，這顯著增加了脊柱軸向應(yīng)力。結(jié)果發(fā)現(xiàn),，小鼠兩側(cè)的小關(guān)節(jié)退變沒(méi)有顯著差異,。與對(duì)照組相比，站立10周后,，關(guān)節(jié)軟骨變薄,，軟骨細(xì)胞減少，OARSI評(píng)分升高（圖1 H-J）,。免疫組化（IHC）染色還表明,，站立10周后，小鼠P53和P21陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加（圖1 K-N）,。這些結(jié)果表明,，F(xiàn)J退變表現(xiàn)出骨關(guān)節(jié)炎的特征，伴有軟骨細(xì)胞衰老,。

圖1   軟骨細(xì)胞衰老與人類(lèi)和小鼠的腰椎小關(guān)節(jié)（FJ）退變有關(guān),。

體外機(jī)械超負(fù)荷誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞衰老和SASP釋放

為了探索體外機(jī)械負(fù)荷是否會(huì)影響軟骨細(xì)胞衰老，分離了原代軟骨細(xì)胞,，在0.5 Hz的頻率下,，用5%和20%的拉伸應(yīng)力加載0h,、6h、12h和24h,。在5%的拉伸應(yīng)力下,，處理6 h后膠原蛋白II含量差異不顯著，12h和24h后其含量增加,。在20%的拉伸應(yīng)力下,，膠原蛋白II含量逐漸降低（圖2 A、B）,。Col2a1的qRT-PCR顯示出類(lèi)似的趨勢(shì)（圖2 C）,。在5%的拉伸應(yīng)力下，MMP13表達(dá)逐漸降低,，而在20%拉伸應(yīng)力下呈時(shí)間依賴(lài)性逐漸升高（圖2 D）,。

然后進(jìn)一步對(duì)SA-β-gal和P21 進(jìn)行染色，以評(píng)估機(jī)械應(yīng)力對(duì)軟骨細(xì)胞衰老的影響,。在5%拉伸應(yīng)力下,，SA-β-gal陽(yáng)性細(xì)胞的比例無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在20%拉伸應(yīng)力下,，SA-β-gal陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量隨刺激時(shí)間的延長(zhǎng)而增加（圖2 E,、G）。P21（紅色）的免疫熒光染色顯示出類(lèi)似的趨勢(shì)（圖2 F,、H）,。qRT-PCR結(jié)果顯示，在20% 拉伸應(yīng)力作用24h后,，PAI-1,、IL-6和TGF-β等SASP因子顯著升高（圖2 I）。這些結(jié)果表明,，適當(dāng)?shù)臋C(jī)械應(yīng)力有利于軟骨細(xì)胞的合成代謝,，并且不會(huì)導(dǎo)致軟骨細(xì)胞衰老。然而,，過(guò)度的機(jī)械應(yīng)力不利于細(xì)胞合成代謝并導(dǎo)致軟骨細(xì)胞衰老,。

圖2   體外過(guò)度的機(jī)械負(fù)荷誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞衰老。

過(guò)度機(jī)械應(yīng)力下軟骨細(xì)胞中MiR-325-3p下調(diào)

為了探索機(jī)械超負(fù)荷誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞衰老的機(jī)制,，通過(guò)篩選關(guān)節(jié)退變和骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的microRNAs進(jìn)行了microRNA陣列分析,。結(jié)果顯示，在這些microRNAs中,，miR-325-3p的降低最為顯著,。接下來(lái)檢測(cè)了小鼠腰椎小關(guān)節(jié)中的miR-325-3p表達(dá)。結(jié)果顯示,，miR-325-3p主要在軟骨層表達(dá),，與對(duì)照組相比,，站立10周后明顯下調(diào)。這些結(jié)果表明,，機(jī)械過(guò)載降低了miR-325-3p在體內(nèi)和體外的表達(dá),。

體外MiR-325-3p過(guò)表達(dá)挽救機(jī)械超負(fù)荷誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞衰老

為了研究miR-325-3p在機(jī)械超負(fù)荷誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞衰老中的作用，構(gòu)建了miR-325-3p模擬物和抑制劑,。在沒(méi)有拉伸應(yīng)力下,，miR-325-3p抑制劑降低了膠原蛋白II的表達(dá)，衰老軟骨細(xì)胞（SA-β-gal和P21陽(yáng)性細(xì)胞）的數(shù)量增加,，衰老相關(guān)基因P21、P16,、P53和SASP因子PAI-1,、IL-6和TGF-β上調(diào)。

然后,，在20%的拉伸應(yīng)力下施用miR-325-3p模擬物,，以確認(rèn)miR-325-3p對(duì)軟骨細(xì)胞衰老的影響。在機(jī)械過(guò)載下,，miR-325-3p模擬物顯著增加膠原II表達(dá),。在20%拉伸應(yīng)力處理24h后，miR-325-3p模擬物可以減少衰老軟骨細(xì)胞（SA-β-gal陽(yáng)性細(xì)胞和p21陽(yáng)性細(xì)胞）的數(shù)量,，明顯降低了衰老相關(guān)基因P21,、P16、P53和SASP因子PAI-1,、IL-6和TGF-β的表達(dá),。這些結(jié)果表明，miR-325-3p可以挽救機(jī)械超負(fù)荷誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷和衰老,。

小鼠雙足站立模型中表達(dá)AAV的miR-325-3p減輕機(jī)械超負(fù)荷誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞衰老和FJ退變

為了探究miR-325-3p對(duì)體內(nèi)軟骨細(xì)胞衰老和FJ退變的影響,，構(gòu)建了表達(dá)miR-325-3p的腺相關(guān)病毒（AAV）。AAV-miR-325-3p促進(jìn)了軟骨細(xì)胞中miR-325-3p的表達(dá)（圖3 A,、B）,。HE和safranin O染色表明，AAV-miR-325-3p增加了軟骨厚度和軟骨細(xì)胞數(shù)量（圖3 C）,。在給予AAV-miR-325-3p后,，OARSI評(píng)分也升高（圖3 D）。

為了評(píng)估AAV-miR-325-3p對(duì)軟骨細(xì)胞衰老的影響,，進(jìn)行了p53和p21的IHC,。與對(duì)照組相比，接受AAV-NC的實(shí)驗(yàn)小鼠p53和p21陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加,，而關(guān)節(jié)內(nèi)注射AAV-miR-325-3p時(shí)衰老軟骨細(xì)胞減少（圖3 E-H）,。IHC染色顯示,，AAV-miR-13-325p處理后，膠原蛋白II陽(yáng)性和蛋白聚糖陽(yáng)性軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯升高,，而MMP 13陽(yáng)性細(xì)胞減少,。這些結(jié)果表明，表達(dá)miR-325-3p的AAV可以有效延緩軟骨細(xì)胞衰老,，減輕機(jī)械超負(fù)荷引起的FJ退變,。

圖3   AAV-miR-325-3p OE（過(guò)表達(dá)）緩解站立模型小鼠腰椎小關(guān)節(jié)軟骨衰老。

MiR-325-3p 通過(guò)靶向 trp53 減輕軟骨細(xì)胞衰老

實(shí)驗(yàn)最后進(jìn)一步探討了miR-325-3p調(diào)控軟骨細(xì)胞衰老的機(jī)制,。通過(guò)預(yù)測(cè)miR-325-3p的下游靶基因和與衰老相關(guān)的GO通路相交,，發(fā)現(xiàn)了5個(gè)潛在基因（Trp53，TBX,，SRF,，Trp63，P21）（圖4 A）,。隨后,，通過(guò)qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，用miR-325-3p模擬物處理后,，軟骨細(xì)胞中Trp53和P21表達(dá)明顯降低,，而TBX、SRF和Trp63的表達(dá)沒(méi)有差異（圖4 B）,。然后驗(yàn)證了miR-325-3p和Trp53之間的結(jié)合關(guān)系,。Trp53的3′UTR具有與miR-325-3p互補(bǔ)的序列（圖4 C）。雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定的結(jié)果表明,，當(dāng)用野生型Trp53質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293個(gè)T細(xì)胞時(shí),，miR-325-3p模擬物降低了熒光素酶活性。當(dāng)273個(gè)T細(xì)胞用突變體Trp53質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時(shí),，未觀察到任何變化,，表明miR-325-3p可以直接靶向Trp53（圖4 D）。

為了進(jìn)一步探討miR-325-3p是否通過(guò)調(diào)控Trp53抑制軟骨細(xì)胞衰老,，使用了濃度為0.5 μM的p53激活劑NSC-207895,。首先探討了miR-325-3p模擬物處理后NSC-207895對(duì)機(jī)械應(yīng)力下軟骨細(xì)胞的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),，NSC-207895可以逆轉(zhuǎn)miR-325-3p在機(jī)械過(guò)載下對(duì)軟骨細(xì)胞的促進(jìn)合成代謝作用,。然后，SA-β-gal染色和P21（紅色）染色顯示,，miR-325-3p減輕機(jī)械過(guò)載誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞衰老,，SA-β-gal陽(yáng)性細(xì)胞和p21陽(yáng)性細(xì)胞減少，但當(dāng)用NSC-207895處理時(shí)，這種效果減弱（圖4 E-G）,。此外,，NSC-207895在mRNA和蛋白質(zhì)水平上分別降低了miR-325-3p模擬物下調(diào)P16、P21和P53表達(dá)的作用（圖4 H-J）,。同時(shí),，miR-325-3p降低了SASP因子PAI-1、IL-6和TGF-β的表達(dá),，然而,，NSC-207895 減弱了這種效果（圖4 H）。這些結(jié)果表明,，miR-325-3p通過(guò)抑制Trp53表達(dá)來(lái)減輕軟骨細(xì)胞衰老和SASP釋放,。

圖4   靶向P53的miR-325-3p和NSC-207895 在體外逆轉(zhuǎn)miR-325-3p抑制機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老的作用。

總之,，該研究表明,，miR-325-3p通過(guò)激活p53/p21通路來(lái)減少軟骨細(xì)胞衰老并減輕機(jī)械過(guò)載誘導(dǎo)的脊柱小關(guān)節(jié)退變，這可能為延緩脊柱小關(guān)節(jié)退變進(jìn)展提供潛在的治療策略,。

參考文獻(xiàn)：Zhao J, Li C, Qin T, Jin Y, He R, Sun Y, Liu Z, Wu T, Duan C, Cao Y, Hu J. Mechanical overloading-induced miR-325-3p reduction promoted chondrocyte senescence and exacerbated facet joint degeneration. Arthritis Res Ther. 2023 Apr 4;25(1):54. doi: 10.1186/s13075-023-03037-3. PMID: 37016437; PMCID: PMC10071751.

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