程序性細(xì)胞死亡受體-1（PD-1）/程序性細(xì)胞死亡配體-1（PD-L1）通路因其在調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫調(diào)控中的作用而被廣泛研究。單抗 PD-1 或單抗 PD-L1 免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICI）治療已被批準(zhǔn)用于10 多種晚期癌癥,，與其他免疫調(diào)節(jié)劑,、靶向治療或細(xì)胞毒性化療的聯(lián)合治療方案可進(jìn)一步提高不同癌癥類型的總生存期（OS）或無病進(jìn)展生存期（PFS）。

對于肝細(xì)胞癌（HCC）,，通過抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）通路的抗血管生成作用是所有已批準(zhǔn)的肝癌多激酶抑制劑（MKI）（一線治療藥物索拉非尼和侖伐替尼,，二線藥物瑞戈非尼和卡博替尼）的常見抗腫瘤機(jī)制，并且廣泛研究了這些MKIs與ICI聯(lián)合用于HCC的治療,。此外,，臨床前研究表明，較高劑量的MKI可能通過誘導(dǎo)缺氧和募集腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）或其他抑制細(xì)胞來而矛盾地誘導(dǎo)免疫抑制,。因此,，確定靶向藥物的最佳免疫調(diào)節(jié)作用對于開發(fā)聯(lián)合免疫療法至關(guān)重要，既可以提高治療指數(shù),，又可以根據(jù)其生物學(xué)有效性和臨床相關(guān)劑量調(diào)整靶向藥物的使用,。

MKI 瑞戈非尼已被批準(zhǔn)作為晚期HCC以及難治性結(jié)直腸癌和胃腸道間質(zhì)瘤的二線治療藥物，但其推薦劑量（每天160 mg,，持續(xù)21天,，然后休息7天）的使用經(jīng)常受到相關(guān)不良事件的限制,，包括手足皮膚反應(yīng)、腹瀉和高血壓,。瑞戈非尼和抗PD-1藥物（納武利尤單抗）聯(lián)合用藥在50例經(jīng)過大量預(yù)處理的晚期胃癌或結(jié)直腸癌患者中顯示出40%的客觀緩解率,，而單獨(dú)使用瑞戈非尼或納武利尤單抗的緩解率低于10%。80 mg/天的瑞戈非尼在這種組合中耐受性良好,，而推薦劑量（160 mg/天）產(chǎn)生明顯的皮膚毒性和其他不良事件,，但療效沒有增加。研究證明,，亞微摩爾范圍內(nèi)的瑞戈非尼可能誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞極化和增加CD8+ T細(xì)胞的增殖和活化,。在體內(nèi)研究中，使用低劑量瑞戈非尼3-5 mg/kg /天,，相當(dāng)于單藥推薦劑量的約50%,，顯示出與抗PD-1治療的協(xié)同抗腫瘤療效。上述研究表明,，瑞戈非尼的最佳免疫調(diào)節(jié)劑量可能低于推薦的單藥治療劑量,，應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化以提高其安全性并促進(jìn)聯(lián)合治療的發(fā)展。

基于此,，國立中國臺灣大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)學(xué)研究所,、國立陽明大學(xué)分子醫(yī)學(xué)、臺北榮民總醫(yī)院腫瘤內(nèi)科的一項(xiàng)研究旨在建立相關(guān)的臨床前模型來表征瑞戈非尼的免疫調(diào)節(jié)作用,，并探索瑞戈非尼對肝細(xì)胞癌的生物學(xué)有效劑量,。低劑量瑞戈非尼（體外≤1μM，體內(nèi)5 mg/kg/天）可通過巨噬細(xì)胞向M1表型極化來增加細(xì)胞毒性T細(xì)胞功能和抗腫瘤免疫,。此外,，p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）通路被確定為介導(dǎo)瑞戈非尼免疫調(diào)節(jié)作用的一種分子機(jī)制。

瑞戈非尼的免疫調(diào)節(jié)作用有助于其體內(nèi)抗腫瘤作用

瑞戈非尼5 mg/kg /天在原位和皮下免疫功能肝癌模型中均發(fā)揮抗腫瘤作用,。瑞戈非尼增加了CD4+ 和CD8+ T細(xì)胞對腫瘤的浸潤,，增加了T細(xì)胞活化、抗原呈遞和巨噬細(xì)胞活化相關(guān)的基因的表達(dá),，并抑制了血管生成相關(guān)的基因,。雖然瑞戈非尼誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡是劑量依賴性的，但較高劑量的瑞戈非尼抑制了體外T細(xì)胞增殖和活化,，表明較高劑量的瑞戈非尼可能與更好的免疫調(diào)節(jié)作用無關(guān),。

然后將瑞戈非尼的抗腫瘤作用與小鼠抗VEGFR2抗體DC-101的抗腫瘤作用在原位肝癌模型中進(jìn)行比較，以確定獨(dú)立于抗VEGFR2作用的可能的免疫調(diào)節(jié)作用,。雖然瑞戈非尼和DC-101都抑制腫瘤血管生成,，但瑞戈非尼誘導(dǎo)更多的T細(xì)胞浸潤到腫瘤中，并且具有更好的抗腫瘤作用（圖1 A）。瑞戈非尼調(diào)節(jié)多種相對不受VEGFR2抑制影響的免疫相關(guān)通路,，如與防御反應(yīng)和白細(xì)胞遷移相關(guān)的通路（圖1 B,、C），并增加腫瘤中活化的CD8+ T細(xì)胞（圖1 D）,。瑞戈非尼降低了體內(nèi)TAMs的總數(shù)（圖1 D）,，并在體外誘導(dǎo)M1/M2巨噬細(xì)胞的凋亡。然而,，流式細(xì)胞術(shù)和多重免疫熒光染色研究均顯示M1/M2比值增加（圖1 D,、E）。相比之下,，DC-101增加了TAMs的總數(shù),，并且不影響巨噬細(xì)胞極化。

因此,，研究假設(shè)巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)可以解釋瑞戈非尼的免疫調(diào)節(jié)作用,，而與其VEGFR2抑制作用無關(guān)。瑞戈非尼和DC-101對巨噬細(xì)胞功能關(guān)鍵信號通路調(diào)控的差異作用支持了這一假設(shè),。瑞戈非尼在M1特征,、IL-12通路、對IFN-γ的反應(yīng)和腫瘤壞死因子（TNFs）靶點(diǎn)方面誘導(dǎo)了更顯著的變化（圖1 F）,。瑞戈非尼和DC-101在分析的其他免疫細(xì)胞中沒有顯著差異,，例如樹突狀細(xì)胞，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞或髓源性抑制細(xì)胞,。

圖1   瑞戈非尼具有免疫調(diào)節(jié)作用，其獨(dú)立于抗血管生成,。

瑞戈非尼通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化增加CD8+ T細(xì)胞的增殖和活化

為了測量瑞戈非尼對巨噬細(xì)胞極化和T細(xì)胞功能的影響,，用瑞戈非尼預(yù)處理小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞（BMDMs）1小時，然后分別用IFN-γ+脂多糖（LPS）（M1表型）或白細(xì)胞介素-4（IL4）（M2表型）極化24小時（圖2 A）,。亞微摩爾劑量的瑞戈非尼增加了M1巨噬細(xì)胞中的M1標(biāo)志物（TNFα,、IL6、MHC II）,，并抑制了M2巨噬細(xì)胞中的M2標(biāo)志物（Arg1,，CD206）（圖2 B）。將小鼠脾細(xì)胞與BMDMs共培養(yǎng),，通過T細(xì)胞增殖和IFN-γ分泌檢測藥物治療前后巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)的CD8+ / CD4+ T細(xì)胞功能（圖2 C）,。瑞戈非尼處理的BMDMs共培養(yǎng)增加了 T 細(xì)胞的增殖和 IFN-γ分泌（圖2 D、E）,。以上數(shù)據(jù)表明,，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能，特別是抑制M2極化，可能在瑞戈非尼的免疫調(diào)節(jié)作用中起關(guān)鍵作用,。

圖2   瑞戈非尼通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化增加CD8+ T細(xì)胞的增殖和活化,。

為了進(jìn)一步闡明瑞戈非尼可能抑制M2巨噬細(xì)胞極化的分子機(jī)制，接下來分析了瑞戈非尼處理的BMDMs中代表性細(xì)胞激酶的RNA表達(dá)和活性,。瑞戈非尼增加了與M1表型相關(guān)的基因表達(dá),，并抑制了M2極化的多種介質(zhì)（圖3 A、B）,，并可抑制可能參與免疫調(diào)節(jié)的多種細(xì)胞激酶（圖3 C）,。在瑞戈非尼調(diào)控的激酶中，p38MAPK受到特別關(guān)注,，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)p38MAPK活化除了在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和對氧化應(yīng)激的反應(yīng)方面具有g(shù)ong:ren的作用外,，還促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞極化。因此,，選擇p38MAPK進(jìn)行進(jìn)一步的機(jī)械探索,。

接下來，分析了瑞戈非尼處理的巨噬細(xì)胞中下調(diào)的基因,，以尋找瑞戈非尼調(diào)控的潛在介質(zhì),。結(jié)果顯示，瑞戈非尼可能調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子,，包括Klf4和cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1（Creb1）,，已知它們對巨噬細(xì)胞活性/存活至關(guān)重要。有趣的是,，p38MAPK已被注意到可以調(diào)節(jié)Creb1磷酸化,。因此，實(shí)驗(yàn)假設(shè)瑞戈非尼通過抑制p38MAPK活性來抑制巨噬細(xì)胞的M2極化,，從而抑制p38MAPK調(diào)節(jié)的Creb1磷酸化以下調(diào)Klf4轉(zhuǎn)錄（圖3 D）,。瑞戈非尼處理的小鼠BMDMs和J774A.1巨噬細(xì)胞系中，其抑制p38MAPK和Creb1磷酸化,，以及Klf4和Ccl7（與M2極化相關(guān)的細(xì)胞因子）的表達(dá)（圖3 E）,。通過 shRNA 敲低 MAPK14或 p38MAPK 抑制劑 SB202190（圖3 F）抑制p38MAPK-Creb1-Klf4 通路對M2標(biāo)記物的調(diào)控效果相似。瑞戈非尼抑制Creb1與Klf4啟動子的cAMP響應(yīng)元件的結(jié)合驗(yàn)證了瑞戈非尼調(diào)節(jié)Creb1與Klf4啟動子的結(jié)合（圖3 G）,。

圖3   瑞戈非尼可以通過抑制p38MAPK-Creb1-Klf4通路來調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化,。

最后，通過抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移和與抗PD-1療法的聯(lián)合治療,，進(jìn)一步探討了瑞戈非尼對適應(yīng)性抗腫瘤免疫的影響,。瑞戈非尼顯著增強(qiáng)了過繼轉(zhuǎn)移的CD8 T細(xì)胞的抗腫瘤能力，這與腫瘤中CD8 T細(xì)胞增加有關(guān),。另一方面,，過繼轉(zhuǎn)移的CD8+ T細(xì)胞在荷瘤小鼠的外周血，脾臟或淋巴結(jié)中的分布與添加瑞戈非尼沒有差異。在肝癌模型中,，與單藥治療相比,，瑞戈非尼和抗PD1療法的組合在腫瘤生長（圖4 A）和生存（圖4 B）方面顯示出協(xié)同抗腫瘤能力。在動物模型中,，單獨(dú)使用瑞戈非尼或瑞戈非尼加抗PD療法可調(diào)節(jié)與白細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)的多個基因,。此外，與單獨(dú)使用瑞戈非尼或抗PD1療法相比,，瑞戈非尼-抗-PD1療法的組合誘導(dǎo)了du;te的基因表達(dá)模式（圖4 C）,，并涉及多種免疫相關(guān)通路（圖4 D）。上述數(shù)據(jù)支持該研究提出的瑞戈非尼調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫的機(jī)制（圖4 E）,。

圖4   瑞戈非尼與抗程序細(xì)胞死亡-1（抗-PD1）療法之間的抗腫瘤協(xié)同作用,。

綜上所述，瑞戈非尼可通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化增強(qiáng)HCC的抗腫瘤免疫力,。這種更安全和生物學(xué)上有效的瑞戈非尼劑量將為聯(lián)合治療提供更好的治療指標(biāo),。未來將需要優(yōu)化臨床前模型，合理設(shè)計基于ICI的聯(lián)合方案,，以及不同免疫調(diào)節(jié)劑之間潛在抗腫瘤協(xié)同作用的機(jī)理探索,。

參考文獻(xiàn)：Ou DL, Chen CW, Hsu CL, Chung CH, Feng ZR, Lee BS, Cheng AL, Yang MH, Hsu C. Regorafenib enhances antitumor immunity via inhibition of p38 kinase/Creb1/Klf4 axis in tumor-associated macrophages. J Immunother Cancer. 2021 Mar;9(3):e001657. doi: 10.1136/jitc-2020-001657. PMID: 33753566; PMCID: PMC7986673.