在牙齒移動(dòng)過(guò)程中,，牙周組織中形成無(wú)菌炎癥微環(huán)境，其特征在于炎癥細(xì)胞因子,，趨化因子的表達(dá)升高和炎癥免疫細(xì)胞的激活增加,。作為牙周組織中的主要間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs）在牙齒移動(dòng)過(guò)程中不斷接受機(jī)械力刺激,，參與炎癥反應(yīng)和骨重建過(guò)程,。

自噬已逐漸被認(rèn)為是在外部刺激（例如應(yīng)激，炎癥,，缺氧和機(jī)械負(fù)荷）下維持細(xì)胞和組織穩(wěn)態(tài)的重要保護(hù)性細(xì)胞過(guò)程,。此外，自噬也可能適應(yīng)機(jī)械負(fù)荷，可以在成骨細(xì)胞,、內(nèi)皮細(xì)胞和 PDLSC s等機(jī)械敏感細(xì)胞中被激活,。然而，PDLSCs中的自噬是否影響機(jī)械力刺激下牙周組織的炎癥微環(huán)境需要進(jìn)一步探索,。

在機(jī)械力誘導(dǎo)的炎癥骨重建過(guò)程中,，巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是重要的免疫細(xì)胞之一。在體內(nèi)復(fù)雜的微環(huán)境中,，其表現(xiàn)出du'te的表型和功能：經(jīng)典型巨噬細(xì)胞極化主要由M1型巨噬細(xì)胞構(gòu)成,，表現(xiàn)出與炎癥和細(xì)胞毒性相關(guān)的功能，另一型巨噬細(xì)胞極化主要由M2型巨噬細(xì)胞構(gòu)成,，與組織修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)相關(guān),。研究已經(jīng)證實(shí)，M1巨噬細(xì)胞極化在牙齒移動(dòng)期間的骨重建和牙根吸收過(guò)程中至關(guān)重要,。

鑒于M1巨噬細(xì)胞極化在牙齒移動(dòng)過(guò)程中的重要性,，北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院、山西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓科聯(lián)合團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究曾假設(shè)PDLSCs中的自噬在機(jī)械力刺激下影響巨噬細(xì)胞極化,，從而影響牙槽骨重建,，研究旨在驗(yàn)證PDLSCs中力誘導(dǎo)的自噬是否以及如何調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化，并有助于牙周炎微環(huán)境和牙齒移動(dòng)過(guò)程中的骨重建,。

PDLSCs中力誘導(dǎo)的自噬有助于體內(nèi)M1巨噬細(xì)胞極化

為了研究機(jī)械力是否可以激活自噬,，建立了牙齒移動(dòng)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，并使用抑制劑3-MA阻斷自噬,。機(jī)械力刺激7天后,，牙齒移動(dòng)距離增加，而注射3-MA可縮短此距離（圖1 A）,。機(jī)械力刺激后,，自噬蛋白LC3、促炎細(xì)胞因子TNF-α和MSC表面標(biāo)志物CD146在牙周組織受壓側(cè)的表達(dá)增加,。同時(shí)，TRAP+ 破骨細(xì)胞數(shù)量也增加（圖1 B,、C）,。3-MA可顯著降低LC3、TNF-α和CD146的表達(dá),，以及TRAP+ 破骨細(xì)胞的數(shù)量,。盡管如此，與對(duì)照組相比,，機(jī)械力+3-MA組CD146 + MSCs 和TRAP+ 破骨細(xì)胞數(shù)量仍上調(diào)（圖1 B,、C）。

為了評(píng)估力誘導(dǎo)自噬對(duì)體內(nèi)巨噬細(xì)胞極化的影響，進(jìn)行了免疫熒光染色以鑒定力刺激后巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的變化,。受力刺激后牙周韌帶受壓側(cè) CD68 + iNOS + M1巨噬細(xì)胞數(shù)量增加,，3-MA注射后顯著減少。雖然機(jī)械力+3-MA處理后CD68 + CD163 + M2巨噬細(xì)胞數(shù)量增加,，但受力刺激后M1/M2巨噬細(xì)胞極化比顯著增加,，3-MA注射后顯著降低（圖1 D）。這些數(shù)據(jù)表明,，自噬調(diào)節(jié)機(jī)械力刺激后的巨噬細(xì)胞的極化,，并影響牙槽骨重建和牙齒移動(dòng)過(guò)程。

圖1   機(jī)械力誘導(dǎo)的自噬有助于體內(nèi)牙齒運(yùn)動(dòng)過(guò)程中的M1巨噬細(xì)胞極化和骨重塑,。

機(jī)械力激活PDLSCs中的自噬

為了探索機(jī)械力下的自噬活性,，在體外對(duì)PDLSCs進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡，免疫熒光染色自噬通量測(cè)定和TEM,。LC3是最重要的自噬相關(guān)蛋白之一,。在12 小時(shí)的0.5-2.5 g/cm2的壓縮力負(fù)荷下，LC3II/I的表達(dá)增加,。然而,，1.0和1.5g/cm2的壓縮力觸發(fā)了LC3II/I 的zui強(qiáng)表達(dá)，隨后在實(shí)驗(yàn)中使用 1.5g/cm2 壓縮力,。

壓縮力刺激3 h后LC3II/I的表達(dá)量開(kāi)始增加,，并持續(xù)至24 h。此外,，在壓縮力刺激2,、6h后，另一種自噬標(biāo)志物P62/SQSTM（P62）的表達(dá)下降,，而B(niǎo)eclin1的表達(dá)在力刺激3h后增加,。實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示，與對(duì)照組相比,，Beclin1的mRNA表達(dá)明顯上調(diào),。免疫熒光染色顯示，在壓縮力刺激12h后,，PDLSCs中聚集的LC3陽(yáng)性表達(dá),，在雷帕霉素應(yīng)用后進(jìn)一步增強(qiáng)。

用壓縮力刺激細(xì)胞12 h,，用顯微鏡檢測(cè)自噬通量,。結(jié)果表明，自噬溶酶體和自噬體的數(shù)量顯著較高,。此外,，壓縮力刺激后,，TEM可在PDLSCs中發(fā)現(xiàn)明顯的自噬體。這些數(shù)據(jù)表明,，在壓縮力刺激下,，PDLSCs的自噬可以在壓縮力依賴性和時(shí)間依賴性趨勢(shì)中被激活。

力刺激的PDLSC自噬在體外誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞極化

為了進(jìn)一步檢測(cè)力刺激的PDLSCs中的自噬是否會(huì)影響巨噬細(xì)胞極化,，使用來(lái)自機(jī)械力刺激的PDLSCs（FS）,、機(jī)械力刺激的PDLSCs + 3-MA處理（FS + 3-MA）或自噬激活劑雷帕霉素（FS + Rapa）的上清液來(lái)處理THP-1來(lái)源的巨噬細(xì)胞，無(wú)力加載作為對(duì)照（CS）（圖2 A）,。

FS組THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞中M1巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物TNF-α和iNOS的mRNA表達(dá)水平上調(diào),，在FS + 3-MA組下調(diào)，而FS + Rapa組進(jìn)一步上調(diào),。然而,，未觀察到M2巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物精氨酸酶-1和DECTIN-1的表達(dá)（圖2 B）。

免疫細(xì)胞化學(xué)分析顯示,，F(xiàn)S組CD68 + iNOS + M1巨噬細(xì)胞比例顯著增加,，在FS + 3-MA組部分被阻斷，而FS + Rapa組增強(qiáng),。然而,，CD68 + CD163 + M2巨噬細(xì)胞的比例沒(méi)有改變（圖2 C、D）,。蛋白質(zhì)印跡分析顯示,，F(xiàn)S組M1巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物iNOS的表達(dá)顯著增加，在FS + 3-MA組下調(diào),，而FS + Rapa組上調(diào)（圖2 E）,。然而，M2巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物精氨酸酶-1的表達(dá)沒(méi)有改變（圖2 E）,。僅應(yīng)用3-MA或雷帕霉素不會(huì)改變THP-1巨噬細(xì)胞中TNF-α或精氨酸酶-1的表達(dá),。這些數(shù)據(jù)表明，在機(jī)械力刺激的PDLSCs中,，自噬可以在體外引導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1表型極化,。

圖2   力刺激的PDLSC自噬在體外誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞極化。

牙周膜干細(xì)胞自噬通過(guò)抑制AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)M1巨噬細(xì)胞極化

在驗(yàn)證了PDLSC自噬與巨噬細(xì)胞極化之間的關(guān)系后,，實(shí)驗(yàn)最后探討了其潛在機(jī)制,。AKT信號(hào)通路已被gong'ren為巨噬細(xì)胞存活和極化的關(guān)鍵介質(zhì)。作為巨噬細(xì)胞中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,，NF-κB 活性的增加引導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1表型極化。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),，當(dāng)將條件培養(yǎng)基應(yīng)用于THP-1來(lái)源的巨噬細(xì)胞中時(shí),，F(xiàn)S組中磷酸化-AKT的表達(dá)受到顯著抑制,，而3-MA（FS + 3-MA）阻斷自噬會(huì)增加磷酸化-AKT的表達(dá)，雷帕霉素增強(qiáng)自噬逆轉(zhuǎn)了上述磷酸化-AKT水平的增加,。相比之下,，在機(jī)械力刺激的PDLSCs的上清液中孵育后，NF-κB / P65的表達(dá)上調(diào),，雷帕霉素進(jìn)一步增強(qiáng),。

為了進(jìn)一步確認(rèn)調(diào)控機(jī)制，將AKT信號(hào)激活劑IGF1和抑制劑GSK690693應(yīng)用于THP-1衍生的巨噬細(xì)胞,。 FS + Rapa+ DMSO組TNF-α和NF-κB/P65的表達(dá)量增加,，IGF1應(yīng)用后降低（圖3 A）。未觀察到M2標(biāo)記精氨酸酶-1的表達(dá)發(fā)生變化,。在FS + Rapa+ DMSO組中,，M1巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物iNOS和TNF-α的mRNA水平一致升高，IGF1應(yīng)用后下降,，而M2巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物精氨酸酶-1和DECTIN-1 的mRNA表達(dá)無(wú)變化（圖3 C）,。

此外，F(xiàn)S + 3-MA + DMSO組TNF-α和NF-κB/P65的表達(dá)下降,。應(yīng)用GSK690693后,，TNF-α和NF-κB/P65的表達(dá)在蛋白質(zhì)水平上顯著增加（圖3 B）。在FS + 3-MA + DMSO組中,，iNOS和TNF-α的mRNA表達(dá)水平一致下降,，應(yīng)用GSK690693后升高，而M2巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物精氨酸酶-1和DECTIN-1 表達(dá)無(wú)變化（圖3 D）,。這些數(shù)據(jù)表明,，機(jī)械力刺激的PDLSCs中的自噬激活通過(guò)抑制AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞極化。

圖3   PDLSC中力誘導(dǎo)的自噬通過(guò)AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)M1巨噬細(xì)胞極化,。

圖4   圖形概要,。

總之，PDLSCs中機(jī)械力刺激的自噬通過(guò)抑制AKT信號(hào)通路引導(dǎo)巨噬細(xì)胞進(jìn)入M1表型,，從而有助于骨重建和牙齒移動(dòng)（圖4）,。這些結(jié)果有助于更好地了解PDLSCs如何響應(yīng)機(jī)械刺激并與巨噬細(xì)胞極化的相互作用，從而調(diào)節(jié)牙槽骨骨重建,。研究結(jié)果還表明,，調(diào)節(jié)MSC自噬可能調(diào)節(jié)炎癥性骨重建和再生過(guò)程。

參考文獻(xiàn)：Jiang N, He D, Ma Y, Su J, Wu X, Cui S, Li Z, Zhou Y, Yu H, Liu Y. Force-Induced Autophagy in Periodontal Ligament Stem Cells Modulates M1 Macrophage Polarization via AKT Signaling. Front Cell Dev Biol. 2021 May 26;9:666631. doi: 10.3389/fcell.2021.666631. PMID: 34124048; PMCID: PMC8187804.