動(dòng)靜脈畸形 （AVMs） 是由供血?jiǎng)用}和引流靜脈之間的直接連接引起的局部血管異常，沒有中間毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò),。腦部動(dòng)靜脈畸形可導(dǎo)致廣泛的器官損傷，繼發(fā)于癲癇和自發(fā)性顱內(nèi)出血。然而，由于腦AVMs（cAVMs）病灶的復(fù)雜血管特性,，該疾病的分子發(fā)病機(jī)制尚未確定。

最近的研究發(fā)現(xiàn),，內(nèi)皮到間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EndMT）可導(dǎo)致AVM病灶的形成,。EndMT過程與內(nèi)皮細(xì)胞對間充質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)有關(guān)，表現(xiàn)為EC的增殖和侵襲,、EC連接紊亂和形成梭形狀,。然而，EndMT的潛在機(jī)制和觸發(fā)因素是模糊的,。Notch信號通路是一種重要的生物學(xué)通路,，它將血流動(dòng)力學(xué)機(jī)械信號與生化信號級聯(lián)聯(lián)系起來，并決定細(xì)胞命運(yùn),。值得注意的是,，增強(qiáng)和減弱的Notch信號通路都與動(dòng)靜脈分流的發(fā)展有關(guān)。由于直接動(dòng)靜脈分流和病灶形成,，AVMs的血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生高度改變,。血流紊亂已被證明對血管內(nèi)皮層有深遠(yuǎn)影響。鑒定響應(yīng)擾動(dòng)流而觸發(fā) EndMT 的調(diào)節(jié)分子可能為治療 cAVM 的藥理學(xué)方法提供新的見解,。

在印度拉吉夫甘地生物技術(shù)中心,、Sree Chitra Tirunal醫(yī)學(xué)科學(xué)和技術(shù)研究所等研究團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)最新研究中，觀察到人類cAVM病灶中存在活化的Notch受體和EndMT標(biāo)志物,，還發(fā)現(xiàn)AVM病灶樣品中細(xì)胞粘附分子的失調(diào),。使用體外流體模型，該研究為內(nèi)皮細(xì)胞中剪切應(yīng)力-Notch3-EndMT軸的改變提供了證據(jù),。Notch信號在感知剪切應(yīng)力波動(dòng)和將細(xì)胞編程成間充質(zhì)特征方面起著關(guān)鍵的中介作用,，他們發(fā)現(xiàn)剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲性改變需要活躍的Notch信號。此外,，還探討了γ-分泌酶抑制劑（GSI）,、DAPT和RO4929097在剪切應(yīng)力改變的情況下預(yù)防Notch誘導(dǎo)的EndMT和細(xì)胞侵襲的效用。

cAVM病灶中EndMT和細(xì)胞粘附標(biāo)志物的失調(diào)

早期研究表明,，cAVM病灶的主要血管具有動(dòng)脈,、靜脈、毛細(xì)血管以及內(nèi)皮標(biāo)志物,。經(jīng)歷間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出改變的形態(tài)特征,，隨后間充質(zhì)蛋白如轉(zhuǎn)凝蛋白（SM22-α）、鈣調(diào)蛋白等增加,。實(shí)驗(yàn)觀察到,，在mRNA轉(zhuǎn)錄本水平上，SNAI1,、Slug（SNAI2）,、轉(zhuǎn)凝蛋白（TAGLN）和鈣調(diào)蛋白1（CNN1）在cAVM樣本中高表達(dá),。與對照相比，SNAI2在cAVM中的表達(dá)比SNAI1更突出（圖1 A）,。

在EndMT過程中,，內(nèi)皮細(xì)胞和基底膜的細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-ECM粘附將被破壞。這些分子變化促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲性,。因此,，研究了cAVM病灶中鈣粘蛋白和整合素等粘附因子的表達(dá)。VE-鈣粘蛋白（CDH5）在患者樣本中下調(diào),，而cAVMs中的N-鈣粘蛋白（CDH2）mRNA上調(diào),。整合素α9亞基（ITGA9）mRNA在cAVMs中過表達(dá)，但整合素β1（ITGB1）mRNA降低,。

此外,，在AVM和對照組織中進(jìn)行了基于免疫組織化學(xué)染色的EndMT蛋白表達(dá)和定位分析。實(shí)驗(yàn)觀察到在AVM大血管的內(nèi)膜區(qū)域存在SNAI1/2的過表達(dá)（圖1 B）,。 SNAI1/2在對照腦血管系統(tǒng)中不表達(dá),。與對照組相比，nidal樣本中的SNAI1/2增加了約4倍（圖1 C）,。鈣調(diào)蛋白1和轉(zhuǎn)凝蛋白在 cAVM 血管巢的內(nèi)膜和中膜中均強(qiáng)烈表達(dá),。轉(zhuǎn)凝蛋白表達(dá)存在于對照組的小血管中，但鈣調(diào)蛋白1在對照血管系統(tǒng)中不表達(dá),。

N-鈣粘蛋白定位于病灶組織的新生內(nèi)膜區(qū)域,，在對照標(biāo)本中未觀察到。也沒有在任何患者樣本的內(nèi)層中觀察到N-鈣粘蛋白,。與對照血管系統(tǒng)相比,，發(fā)現(xiàn)整合素的活化形式α9/β1在cAVM病灶中下調(diào)。

圖1   腦動(dòng)靜脈畸形中 EndMT 和主要細(xì)胞粘附標(biāo)志物的失調(diào),。

腦動(dòng)靜脈畸形表達(dá)更高水平的NICD3和NICD4

實(shí)驗(yàn)最初研究了cAVM病灶中所有四個(gè)Notch受體基因Notch 1-4的表達(dá),，發(fā)現(xiàn)Notch3和Notch4 mRNA在病灶標(biāo)本中顯著過表達(dá)。然后專門研究了激活的Notch受體的表達(dá),，即cAVM組織切片和對照腦樣本中的Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD）,。NICD3被發(fā)現(xiàn)高度表達(dá)并定位于血管巢的內(nèi)膜和中膜，表明EndMT,。cAVM中的NICD4受體水平較低,，并且呈彌散模式，更靠近內(nèi)膜,，較少在中膜分布,。蛋白質(zhì)印跡分析進(jìn)一步證實(shí)了AVM病灶中NICD3的表達(dá)升高。

振蕩流促進(jìn) γ-分泌酶依賴性 Notch 受體的激活

為了確定內(nèi)皮細(xì)胞中是否發(fā)生振蕩剪切應(yīng)力依賴性Notch受體活化,，實(shí)驗(yàn)使用流動(dòng)室在暴露于規(guī)定流動(dòng)條件下的hCMECs中進(jìn)行基于qRT-PCR的mRNA分析和蛋白質(zhì)免疫熒光測定,，分析了暴露于平行剪切應(yīng)力（15 dyn/cm2）24 h的hCMECs中的基因表達(dá)譜,。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Notch1-4在平行單向流動(dòng)條件下的mRNA表達(dá)與靜態(tài)流動(dòng)條件下的表達(dá)沒有顯著差異（圖2 A）,。與靜態(tài)相比,，振蕩流（15 dyn/cm2）誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中Notch3（4.11倍）和Notch4（2.06倍）mRNA的過表達(dá)。與暴露于平行流的細(xì)胞相比,，振蕩流分別導(dǎo)致Notch3和Notch4增加了3.2倍和1.96倍。與靜態(tài)條件相比,，平行流和振蕩流均未在hCMECs中誘導(dǎo)顯著的Notch1和Notch2表達(dá)（圖2 A）,。

接下來，研究了暴露于各種流動(dòng)條件的 hCMECs 中的 NICD 1,、3 和 4 蛋白水平表達(dá)及其細(xì)胞定位,。與平行流和靜態(tài)條件相比，暴露于振蕩剪切應(yīng)力的內(nèi)皮細(xì)胞中存在NICD3的過表達(dá),。振蕩剪切應(yīng)力通過促進(jìn)NICD3的核定位改變了Notch3受體的亞細(xì)胞定位,。還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在24小時(shí)后以紡錘狀形態(tài)拉長。NICD4表達(dá)略有升高,，但定位主要是細(xì)胞質(zhì),。NICD1在三種流動(dòng)條件下的細(xì)胞中均未顯著表達(dá)，但MFI分析表明暴露于振蕩流的細(xì)胞中略有過表達(dá)（圖2 B,、C）,。

此外，還研究了振蕩剪切應(yīng)力是否通過誘導(dǎo)γ分泌酶活性直接誘導(dǎo)Notch受體激活,，用0.5µM DAPT和250 nM RO4929097對暴露于振蕩流24 h 的hCMECs進(jìn)行處理,。兩種抑制劑都對hCMECs中γ-分泌酶誘導(dǎo)的Notch3受體的剪切應(yīng)力反應(yīng)產(chǎn)生了負(fù)面影響（圖2 D）。然而,，RO4929097更具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2 E）,。蛋白質(zhì)印跡分析進(jìn)一步證實(shí)了暴露于振蕩流的細(xì)胞中NICD3蛋白水平表達(dá)升高（圖2 F）。

圖2   通過人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（hCMEC/d3）中的振蕩液流激活Notch受體,。

振蕩流誘導(dǎo)的 EndMT 需要 Notch 受體激活

hCMECs被用來研究振蕩剪切應(yīng)力下內(nèi)皮標(biāo)志物的喪失和間充質(zhì)特征的增強(qiáng),。mRNA表達(dá)分析顯示，與靜態(tài)相比,，暴露于振蕩剪切應(yīng)力的細(xì)胞中間充質(zhì)CNN1和TAGLN上調(diào),。關(guān)鍵的EndMT標(biāo)記物SNAI1和SNAI2的mRNA在振蕩流暴露細(xì)胞中也分別過表達(dá)3.59倍和3.83倍（圖3 A）。在暴露于振蕩流的細(xì)胞中,，與SNAI1相比,，Slug表達(dá)略高，證實(shí)了cAVM中的發(fā)現(xiàn),。

對暴露于靜態(tài),、平行和振蕩剪切應(yīng)力的hCMECs中的SNAI1/2進(jìn)行免疫熒光分析,。與其他流動(dòng)狀態(tài)相比，SNAI1/2 在振蕩流的細(xì)胞中過表達(dá)并定位于細(xì)胞核（圖3 B）,。MFI分析表明,，與靜態(tài)流和平行流相比，SNAI1/2表達(dá)分別增加了3.8倍和3.1倍（圖3 C）,。

為了評估hCMECs中Notch通路在剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的EndMT中的參與,，在振蕩流過程中使用了GSI DAPT（0.5μM）和RO4929097（250 nM），并監(jiān)測EndMT因子的表達(dá),。在振蕩應(yīng)力期間SNAI1/2在DAPT和RO4929097 下分別降低了約60%和80%,，而抑制Notch受體切割消除了此影響（圖4 A、B）,。這些數(shù)據(jù)表明,，振蕩剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的EndMT需要Notch 信號。γ-分泌酶抑制劑RO4929097在改變流動(dòng)條件下減少內(nèi)皮細(xì)胞的間充質(zhì)表型非常有效,。

圖3   微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的振蕩流對 EndMT 和細(xì)胞粘附標(biāo)志物的差異表達(dá),。

圖4   γ-分泌酶抑制劑（GSI）調(diào)節(jié)振蕩剪切誘導(dǎo)的EndMT和細(xì)胞侵襲性。

RO4929097促進(jìn)細(xì)胞粘附并減少暴露于振蕩流細(xì)胞的侵襲性

為了證實(shí)cAVM組織中細(xì)胞粘附因子失調(diào)的發(fā)現(xiàn),，通過qRT-PCR研究了暴露于各種流動(dòng)條件的內(nèi)皮細(xì)胞中內(nèi)皮VE-鈣粘蛋白,，間充質(zhì)N-鈣粘蛋白和整合素亞基α9和β1的基因的mRNA表達(dá)。在暴露于振蕩剪切應(yīng)力的細(xì)胞中N-鈣粘蛋白和整合素α9上調(diào),，而VE-鈣粘蛋白和整合素β1下調(diào)（圖3 A）,。

暴露于剪切應(yīng)力條件的細(xì)胞中這些粘附因子的免疫熒光測定表明，與暴露于靜態(tài)和平行剪切應(yīng)力的細(xì)胞相比,，振蕩剪切應(yīng)力下的細(xì)胞中N-鈣粘蛋白上調(diào),。在暴露于振蕩流24 h 的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)激活的整合素α9/ β1顯著降低（圖3 B、C）,。

DAPT和RO4929097顯著降低了暴露于持續(xù)振蕩流的細(xì)胞中的N-鈣粘蛋白,。有趣的是，在DAPT和RO4929097 存在下,，整合素α9/ β1表達(dá)分別增加了45.5%和56.7%（圖4 A,、B）。

細(xì)胞侵襲性增加是EndMT的一個(gè)重要結(jié)果,。為了研究hCMECs在流動(dòng)狀態(tài)下的侵襲特性,，使用Matrigel跨膜侵襲測定。先前將細(xì)胞暴露于振蕩剪切應(yīng)力24小時(shí)誘導(dǎo)內(nèi)皮侵襲性增加,，DAPT和RO4929097均基本阻斷了內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲性（圖4 C）,。與DAPT相比，RO4929097有效防止細(xì)胞侵襲（圖4 D）。這一發(fā)現(xiàn)表明,，靶向Notch信號通路的藥物干預(yù)可以有效降低血流誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞侵襲能力和EndMT,。

圖5    圖形概要

總之，該研究表明,，在人類cAVM病灶中存在Notch受體和EndMT標(biāo)志物,。這是第一份報(bào)告，表明改變的血流誘導(dǎo)的Notch信號導(dǎo)致cAVMs中的EndMT,，提供了Notch信號在內(nèi)皮細(xì)胞暴露于干擾流中增強(qiáng)細(xì)胞侵襲性的直接作用的證據(jù),。

參考文獻(xiàn)：Karthika CL, Venugopal V, Sreelakshmi BJ, Krithika S, Thomas JM, Abraham M, Kartha CC, Rajavelu A, Sumi S. Oscillatory shear stress modulates Notch-mediated endothelial mesenchymal plasticity in cerebral arteriovenous malformations. Cell Mol Biol Lett. 2023 Mar 18;28(1):22. doi: 10.1186/s11658-023-00436-x. PMID: 36934253; PMCID: PMC10024393.