研究表明,，內皮-間充質轉化（EndoMT）參與病理性血管重塑過程。作為內皮細胞的前體細胞,，內皮祖細胞（EPCs）EndoMT也是病理性血管重塑的常見機制。此外,，振蕩剪切應力（OSS）促進了EPC EndoMT,。EPCs暴露于OSS后，內皮細胞標志物VE-鈣粘蛋白和CD31的表達下調,。同時,，間充質細胞標志物α-SMA和SM22α的表達顯著增加。因此,，濰坊醫(yī)學院基礎醫(yī)學院,、淄博市中心醫(yī)院轉化醫(yī)學中心的一項研究探討了OSS誘導的EPC EndoMT的機制，以期進一步闡明OSS對EPC EndoMT的影響以及病理性血管重塑的發(fā)生和發(fā)展,。

外泌體（Exos）是具有完整膜結構（直徑30-150nm）的納米級細胞外囊泡,，主要負責細胞間的物質運輸和信息傳遞。Exos被認為是細胞-細胞通訊的重要介質,，參與許多生理和病理過程,。在這項研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)OSS處理的EPCs釋放的Exos（OSS-Exos）可以誘導EPC EndoMT,。但內部機制有待進一步探討,。

最近，Exos中的環(huán)形RNAs（circRNAs）引起了廣泛的關注,。CircRNAs具有共價閉環(huán)結構,。新出現(xiàn)的證據表明，外泌體circRNAs在復雜的人類病理學中起著重要作用,。此外,，circRNAs可以充當miRNA分子的“海綿"，抑制miRNA與靶基因mRNAs的結合，從而促進靶基因的轉錄,。

該團隊使用高通量測序技術研究了暴露于OSS的EPCs中circRNAs的表達譜,。基于生物信息學分析和實驗驗證,，發(fā)現(xiàn)circ-1199被OSS顯著上調并明顯加載到Exos中,。然而，OSS誘導的EPC EndoMT是否由外泌體circ-1199介導目前尚不清楚,。該研究旨在探討 Exos  和外泌體circ-1199對EPC EndoMT的影響和可能機制,。

從 OSS 處理的 EPCs 灌流液中分離的Exos誘導 EPC EndoMT 

EPCs分泌的Exos影響血管細胞和組織功能，實驗首先確定了Exos是否參與OSS（±3.5 dyne/cm2,，1 Hz）誘導的EPC EndoMT,。從細胞上清液（Static-Exos）或灌流液（OSS-Exos）中分離Exos。WB揭示了EPCs衍生的Exos表達CD9,、CD81和CD63,，它們是Exos的代表標志物。

為了評估OSS-Exos對EPC的影響,，PKH26標記的Exos與EPCs的共培養(yǎng),，發(fā)現(xiàn)這些Exos被EPCs有效地吸收（圖1 D）。EdU測定結果表明,，OSS-Exos顯著增加了EPCs的增殖（圖1 E）,。RT-qPCR和WB結果顯示，OSS-Exos下調內皮標志物CD31和VE-鈣粘蛋白的表達,，上調間充質細胞標志物α-SMA和SM22α的表達（圖1 F,、G）。這些數(shù)據表明,，OSS-Exos在EPCs中誘導了EndoMT,。

圖1    OSS-Exos誘導EPC增殖和EndoMT。

Circ-1199 在用 OSS 和 OSS-Exos 處理的 EPCs 中顯著上調

通過高通量RNA測序篩選用OSS處理的EPCs中表達的circRNAs,。如圖2 A-B所示,，基于生物信息學分析，選擇circ-1199作為靶向circRNA,。接下來,，通過RT-qPCR證實了circ-1199在OSS 加載的EPCs中的表達。結果表明,，當EPCs加載OSS持續(xù) 3,、6、12,、24 h時,，circ-1199在6 h后增加,，并在24 h內保持較高水平（圖2 C）。此外,，RNA FISH表明EPCs在靜態(tài)狀態(tài)下很少表達circ-1199,，但在OSS加載后circ-1199陽性細胞數(shù)量明顯增加（圖2 D）。

接下來,，進行RT-qPCR和RNA FISH測定以測量Exos中circ-1199的表達,。RT-qPCR結果顯示，OSS-Exos中circ-1199的水平高于靜態(tài)-Exos（圖2 E）,。RNA FISH結果表明,，當Exos與EPCs共培養(yǎng)時，OSS-Exos處理的EPCs中circ-1199的表達高于靜態(tài)-Exos處理的EPCs（圖2 F）,。

圖2   Circ-1199在用OSS處理的EPC中異常表達,。

Circ-1199 促進了 EPC EndoMT

為了評估circ-1199對EPC EndoMT的影響，將circ-1199過表達慢病毒載體（LV-circ-1199）轉染到EPCs中,。結果表明,，用LV-circ-1199轉染EPCs后，circ-1199的表達明顯上調,，增殖明顯增加,。此外，內皮細胞標志物VE-鈣粘蛋白和CD31的表達降低,，而間充質標志物α-SMA和SM22α的表達在基因和蛋白質水平均上調。這些結果與用OSS-Exos處理的EPCs的結果一致,。

Circ-1199–let-7g-5p–HMGA2 ceRNA 參與 EPC EndoMT

新興研究表明,，circRNAs的主要機制是作為miRNA的海綿，從而釋放miRNAs對靶基因的抑制作用,。然后,，實驗預測了miRNAs和circRNAs之間的結合位點。結果表明,，circ-1199具有兩種類型的miRNAs（miR-520f和let-7g-5p）的結合位點,，let-7g-5p表現(xiàn)出更多的結合位點。同時,，獲得了94個靶基因作為let-7g-5p候選基因,，其中HMGA2得分最高。雙熒光素酶報告基因測定顯示,，circ-1199有效結合let-7g-5p（圖3 C）,，let-7g-5p也與HMGA2 mRNA的3′UTR結合（圖3 D）。RT-qPCR結果表明,，circ-1199的過表達降低了let-7g-5p的表達,，同時增加了HMGA2的表達（圖3 E）,。此外，let-7g-5p模擬物（圖3 F）和LV-shHMGA2（圖3 G）都下調了EPCs中α-SMA和SM22α的表達,。

有趣的是,，用OSS-Exos處理EPCs后，circ-1199的表達增加（圖3 H）,。同時,，let-7g-5p的表達降低（圖3 I），HMGA2顯著增加（圖3 J）,。WB結果證實了HMGA2的上調表達（圖3 K）,。

這些結果表明，OSS-Exos可以上調circ-1199,，從而可能發(fā)揮分子“海綿"的作用吸附let-7g-5p,，從而增加HMGA2的表達。

圖3   Circ-1199–let-7g-5p–HMGA2 ceRNA參與EPC EndoMT,。

Circ-1199–let-7g-5p–HMGA2 調節(jié) EPC 轉錄因子 Smad3 和 Snail

據報道,，多種信號通路，如TGF-β/Smad信號,、Wnt/β-連環(huán)蛋白信號和Notch信號通路,，都參與了EndoMT的轉錄調控。研究表明,，HMGA2上調TGF-β/Smad信號通路中Snail,、Twist 和Slug 的表達，從而導致上皮細胞中上皮到間充質的轉化（EMT）,。因此,，實驗進一步研究了轉錄因子Smad3和Snail是否參與EPCs的EndoMT過程。WB結果表明,，OSS-Exos處理EPCs后,，p-Smad3/Smad3和Snail的蛋白表達明顯上調。

為了進一步了解OSS-Exos激活EPCs中EndoMT相關轉錄因子的機制,，在用LV-circ-1199,，let-7g-5p模擬物或LV-shHMGA2預處理EPCs后測量了HMGA2，p-Smad3 / Smad3和Snail的表達,。結果表明,，經LV-circ-1199、let-7g-5p模擬物和LV-shHMGA2處理后,，HMGA2,、p-Smad3/Smad3和Snail 的表達均上調。然而,，let-7g-5p模擬物和LV-shHMGA2抑制了EPCs中HMGA2,，p-Smad3/Smad3和Snail的表達,。

這些結果表明，circ-1199–let-7g-5p–HMGA2參與了EPCs中OSS-Exos誘導的p-Smad3/Smad3和 Snail 的激活,。

OSS-Exos 和 circ-1199 在體外和體內都損傷了 EPCs 的血管生成

血管生成能力是EPCs的重要功能,。血管生成能力下降是 EPC s中 EndoMT 之后的標志性事件。為了進一步研究OSS-Exos對EPC功能的影響,，實驗在體外評估了血管生成,。結果表明，OSS-Exos組EPC血管生成顯著降低（圖4 A）,。此外,，用LV-circ-1199轉染后，EPCs的血管生成能力也明顯降低（圖4 B）,。

接下來,，使用Matrigel plug 測定法來測定小鼠體內EPCs的血管生成。結果表明,，用OSS-Exos處理的EPCs形成較少的血管樣結構（圖4 C）,。此外，在OSS-Exos處理的EPCs中,，CD31和vWF的表達降低（圖4 D）,，α-SMA和SM22α的表達增加（圖4 E）。

此外,，與對照組相比,，用LV-circ-1199處理EPCs后，血管狀結構的數(shù)量減少（圖4 F）,。同時,，內皮標志物CD31和vWF的表達降低（圖4 G），但間充質標志物α-SMA和SM22α的表達明顯增加（圖4 H）,。

圖4   OSS-Exos和circ-1199在體外和體內都損害了EPCs的血管生成。

圖5  在Exos circ-1199處理后 EPC EndoMT的機制,。

綜上所述,，在OSS-Exos中富集的circ-1199促進EPC EndoMT并作為let-7g-5p的分子海綿，從而上調HMGA2的表達,。然后p-Smad3/Smad3/Snail 可能參與這個過程（圖5）,。

參考文獻：Li L, Wen J, Li H, He Y, Cui X, Zhang X, Guan X, Li Z, Cheng M. Exosomal circ-1199 derived from EPCs exposed to oscillating shear stress acts as a sponge of let-7g-5p to promote endothelial-mesenchymal transition of EPCs by increasing HMGA2 expression. Life Sci. 2023 Jan 1;312:121223. doi: 10.1016/j.lfs.2022.121223. Epub 2022 Nov 23. PMID: 36435223.