牙周膜細(xì)胞（PDL）細(xì)胞是牙周再生治療的有前途的工具,。獲得足夠數(shù)量的PDL細(xì)胞對(duì)于PDL再生至關(guān)重要,。PDL細(xì)胞的再生潛力已經(jīng)在大型動(dòng)物模型中進(jìn)行了研究,，并報(bào)道了其臨床結(jié)果,。然而,，由于它們對(duì)組織資源和增殖能力的限制，開發(fā)有效的方法來(lái)擴(kuò)增PDL細(xì)胞以進(jìn)行牙周再生至關(guān)重要,。

PDL位于牙槽骨和牙骨質(zhì)之間,，它持續(xù)感知機(jī)械力，例如正畸牙齒移動(dòng)（OTM）或咀嚼過(guò)程中的拉伸應(yīng)力,、壓應(yīng)力和剪切應(yīng)力,。PDL細(xì)胞感知并響應(yīng)機(jī)械應(yīng)力，這對(duì)于組織穩(wěn)態(tài)和重塑至關(guān)重要,。

YAP是Hippo通路的共轉(zhuǎn)錄因子,，在細(xì)胞增殖、遷移和分化中起重要作用,。此外,，YAP還具有機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)特性,。有研究報(bào)道，細(xì)胞骨架張力可以調(diào)節(jié)zyxin 蛋白,，其介導(dǎo)人PDL成纖維細(xì)胞中YAP的核轉(zhuǎn)運(yùn),。然而，YAP是否參與剪切應(yīng)力介導(dǎo)的PDL細(xì)胞增殖以及上游調(diào)節(jié)因子尚不清楚,。

基于此,，北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院北京生物醫(yī)學(xué)工程高精尖中心、生物力學(xué)與力學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的一項(xiàng)研究探討了流體剪切應(yīng)力（FSS）介導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞增殖機(jī)制,，研究結(jié)果為PDL細(xì)胞增殖作為PDL組織再生的可行方法提供了新的見解,，對(duì)p38-AMOT-YAP機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的觀察為牙齒運(yùn)動(dòng)和牙齒矯形提供了啟示。

FSS促進(jìn)PDL細(xì)胞增殖并重排細(xì)胞骨架和核形狀

為了研究FSS對(duì)PDL細(xì)胞增殖的影響,，用1,、3、6和9 dyn/cm2的 FSS 持續(xù)4小時(shí)來(lái)量化EdU陽(yáng)性PDL細(xì)胞,。在這項(xiàng)研究中,，1-6 dyn/cm2的FSS促進(jìn)細(xì)胞增殖，但9 dyn/cm2的FSS抑制細(xì)胞增殖,。此外,，6 dyn/cm2 的FSS效果zui'好，EdU陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量從24.41%±4.01%增加到43.13%±6.03%（圖1 A,、B）。因此,，實(shí)驗(yàn)選擇了 6 dyn/cm2的FSS在隨后的實(shí)驗(yàn)中,。

將PDL細(xì)胞暴露于6 dyn/cm2的FSS，與靜態(tài)對(duì)照相比,，細(xì)胞保持了更高的活力（圖1 C）,。為了研究FSS對(duì)PDL細(xì)胞骨架重塑的影響，將PDL細(xì)胞暴露于6 dyn/cm2 FSS中持續(xù)5分鐘,，10分鐘,，30分鐘，1小時(shí),，2小時(shí)和4小時(shí),，結(jié)果增加了F-肌動(dòng)蛋白絲的密度（圖1 D、E）,。投影面積減小,，細(xì)胞形狀指數(shù)呈時(shí)間依賴性增加（圖1 F、G）,，表明FSS可以將細(xì)胞形狀改變?yōu)楦「鼒A,。接下來(lái)，研究了FSS介導(dǎo)的細(xì)胞粘附。有趣的是,，F(xiàn)SS似乎在二相模型中調(diào)節(jié)FAK和Paxillin,。它在1-5分鐘后增加了FAK和Paxillin的長(zhǎng)度。然而,，這些參數(shù)在FSS超過(guò)30分鐘后下降（圖1 D,、H）。

當(dāng)FSS持續(xù)5分鐘-4小時(shí)時(shí),，核厚度在10分鐘內(nèi)下降,，并在30分鐘后增加。核面積在10分鐘內(nèi)增加,，并在30分鐘后降低（圖1 I-K）,。然而，F(xiàn)SS沒(méi)有改變核體積（圖1 L）,，表明在FSS的10分鐘內(nèi),，細(xì)胞核變得更平坦，但在30分鐘后,，它們達(dá)到了更立體的形狀,。肌動(dòng)蛋白帽在10 分鐘內(nèi)增加，30 分鐘后減?。▓D1 M,、N），肌動(dòng)蛋白帽的總熒光強(qiáng)度與核厚度呈高度相關(guān)（圖1 O）,，表明FSS促進(jìn)肌動(dòng)蛋白帽擴(kuò)增和壓縮細(xì)胞核,。然后進(jìn)一步研究了FSS在10分鐘內(nèi)對(duì)核孔的影響。結(jié)果表明,，5-10 分鐘的FSS擴(kuò)張了核孔徑（圖1 P,、Q）。

圖1   FSS促進(jìn)PDL細(xì)胞增殖,，重新排列細(xì)胞骨架,，改變細(xì)胞核形狀。

YAP參與FSS誘導(dǎo)的PDL細(xì)胞增殖

接下來(lái)研究了YAP在FSS誘導(dǎo)的PDL細(xì)胞增殖中的作用,。結(jié)果表明,，YAP在FSS的持續(xù)時(shí)間內(nèi)顯示出動(dòng)態(tài)易位。它們?cè)?-10分鐘內(nèi)響應(yīng)FSS在細(xì)胞核中積聚,。然而,，在FSS持續(xù)的30分鐘、1小時(shí),、2小時(shí)或4小時(shí)后,，YAP被排除在細(xì)胞核之外,。YAP比值的N/C與核厚度高度相關(guān)，表明核形狀的變化影響YAP核定位,。核轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑（LMB）阻斷FSS誘導(dǎo)的YAP轉(zhuǎn)錄輸出1小時(shí),，這表明核孔輸出對(duì)于FSS誘導(dǎo)的YAP至關(guān)重要。YAP的Ser127是LATS1/2的關(guān)鍵靶點(diǎn),，F(xiàn)SS將其下調(diào),。YAP靶基因，如CTGF和ANKRD30,，在4 分鐘-2 小時(shí)FSS下被促進(jìn),，表明下游基因被FSS持續(xù)激活。這些結(jié)果表明,，盡管FSS誘導(dǎo)的YAP定位是動(dòng)態(tài)的,，但下游基因的激活及其抑制的磷酸化持續(xù)存在。當(dāng)敲低YAP時(shí),，F(xiàn)SS誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖被阻斷,。這些結(jié)果表明，F(xiàn)SS調(diào)控的YAP在FSS誘導(dǎo)的PDL細(xì)胞增殖中起關(guān)鍵作用,。

LATS1/2是調(diào)節(jié)Hippo 通路中YAP激活的上游激酶,。數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)SS可以調(diào)節(jié)LATS1/2活性,，從而調(diào)節(jié)YAP的定位和激活,。當(dāng)LATS1/2沉默時(shí)，即使在對(duì)照細(xì)胞中,，F(xiàn)SS也未能促進(jìn)細(xì)胞增殖,。這些結(jié)果表明，LATS參與FSS誘導(dǎo)的YAP調(diào)控,，并在FSS誘導(dǎo)的PDL細(xì)胞增殖中發(fā)揮作用,。

p38通過(guò)調(diào)節(jié)PDL細(xì)胞中的LATS和YAP來(lái)調(diào)節(jié)FSS誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖

據(jù)報(bào)道MAPK信號(hào)通路可調(diào)節(jié)YAP活性,。在研究中,，6 dyn/cm2 的FSS可以在5-30分鐘內(nèi)快速激活ERK、p30和JNK,。當(dāng)PDL細(xì)胞分別用ERK,，p38和JNK抑制劑預(yù)處理時(shí)，p38抑制劑（而不是JNK和ERK抑制劑）減少了FSS誘導(dǎo)的YAP核聚集,。被FSS降低的pYAP表達(dá)被p38抑制劑恢復(fù),，但JNK或ERK抑制劑不能。CTGF和ANKRD1的表達(dá)也有類似的趨勢(shì),。因此進(jìn)一步研究了p38的作用,，發(fā)現(xiàn)FSS誘導(dǎo)的增殖被p38抑制劑顯著破壞,，但JNK和ERK抑制劑沒(méi)有。由于FSS下調(diào)了pLATS1,，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)只有p38抑制劑可以在FSS下挽救pLATS1表達(dá),。這些結(jié)果表明，p38通過(guò)抑制LATS磷酸化和促進(jìn)YAP活性來(lái)調(diào)節(jié)FSS誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖,。

細(xì)胞骨架和LINC調(diào)控FSS誘導(dǎo)的YAP定位

已知YAP受細(xì)胞骨架高度調(diào)控,。為了研究細(xì)胞骨架在FSS誘導(dǎo)的YAP定位中的作用，使用不同的細(xì)胞骨架抑制劑：細(xì)胞松弛素D（Cyto D）,、Rho激酶抑制劑Y-27632,、非肌肉肌球蛋白II型ATP酶抑制劑Bleb，以干擾細(xì)胞骨架的不同方面,。結(jié)果表明,，F(xiàn)SS下肌動(dòng)蛋白絲受損符合YAP的核排出。相反,，當(dāng)細(xì)胞與促進(jìn)肌動(dòng)蛋白聚合的誘導(dǎo)劑Jasp孵育時(shí),，F(xiàn)SS誘導(dǎo)的YAP的核定位增加（圖2 A、B）,，表明肌動(dòng)蛋白絲的完整性在FSS誘導(dǎo)的YAP定位中起重要作用,。這些細(xì)胞骨架試劑也調(diào)節(jié)細(xì)胞核形狀。細(xì)胞骨架抑制劑受損提高了核高度并減少了核面積,。然而,，Jasp具有相反的效果（圖2 C-F）。已知LINC復(fù)合物將力從細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞骨架傳遞到細(xì)胞核,。當(dāng)沉默將肌動(dòng)蛋白連接到LINC的nesprin1時(shí),，F(xiàn)SS誘導(dǎo)的F-肌動(dòng)蛋白形成和YAP核定位受到阻礙（圖2 G、H）,。當(dāng)nesprin1被敲低時(shí),，F(xiàn)SS促進(jìn)的F-肌動(dòng)蛋白和paxillin 也降低（圖2 I）。沉默的nesprin1取消了FSS增加的肌動(dòng)蛋白帽和核扁平化（圖2 J-O）,。這些結(jié)果表明,，LINC對(duì)于FSS從細(xì)胞骨架到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)導(dǎo)至關(guān)重要，它參與了FSS誘導(dǎo)的YAP轉(zhuǎn)運(yùn),。

圖2   細(xì)胞骨架和LINC參與PDL細(xì)胞中FSS誘導(dǎo)的YAP定位,。

p38 影響 Akt/cofilin 和 LATS 以調(diào)節(jié) FSS 誘導(dǎo)的 PDL 細(xì)胞中 F-肌動(dòng)蛋白聚合

Akt和cofilin是調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白聚合的關(guān)鍵因子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,，在FSS作用5-30分鐘后,，pAkt/Akt的表達(dá)增加，而Akt表達(dá)沒(méi)有變化（圖3 A）,。此外,，pcofilin/cofilin的水平也在FSS作用5-30分鐘后上調(diào),，而cofilin水平?jīng)]有影響（圖3 B）。當(dāng)cofilin沉默時(shí),，F(xiàn)SS上調(diào)YAP核定位,，下游基因表達(dá)進(jìn)一步增加，趨勢(shì)與F-肌動(dòng)蛋白形成相同（圖3 C-G）,。當(dāng)使用Akt抑制劑MK2206和PI3K抑制劑LY294002時(shí),，F(xiàn)SS誘導(dǎo)的pcofilin表達(dá)受到抑制（圖3 H）。當(dāng)PDL細(xì)胞與p38抑制劑預(yù)培養(yǎng)并加載6 dyn/cm2的FSS 時(shí),，pAkt/Akt和pcofilin/cofilin,，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白的水平降低（圖3 I-L）。這表明,，p38對(duì)肌動(dòng)蛋白聚合至關(guān)重要,。

為了證明LATS1和Akt的關(guān)系，將MK-2206與PDL細(xì)胞一起孵育以抑制Akt活性,。結(jié)果表明,，被FSS降低的pLATS1/LATS1表達(dá)被Akt抑制劑恢復(fù)（圖3 M）。相反,，敲低LATS1/2幾乎沒(méi)有影響FSS介導(dǎo)的Akt活性,。由于p38可以抑制pLATS水平，因此當(dāng)沉默LATS1/2,，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白密度增加,，并且對(duì)FSS沒(méi)有反應(yīng)（圖3 N、O）,。當(dāng)LATS1/2被敲低時(shí),，對(duì)照組中肌動(dòng)蛋白帽增加，F(xiàn)SS不能增強(qiáng)（圖3 P,、Q）,。沉默LATS1/2進(jìn)一步增加了FSS誘導(dǎo)的核扁平化，對(duì)FSS調(diào)節(jié)沒(méi)有反應(yīng)（圖3 R-U）,。這些結(jié)果表明,，F(xiàn)SS激活了p38，隨后激活了Akt,，Akt磷酸化cofilin,，促進(jìn)了F-肌動(dòng)蛋白聚合,。Akt的激活參與了LATS磷酸化的抑制,。受p38抑制的LATS負(fù)調(diào)節(jié)F-肌動(dòng)蛋白，肌動(dòng)蛋白帽形成和核扁平化,。因此,，F(xiàn)SS誘導(dǎo)的F-肌動(dòng)蛋白聚合增加了YAP核易位,。

圖3   p38影響Akt/cofilin和LATS調(diào)節(jié)FSS誘導(dǎo)的PDL細(xì)胞中F-肌動(dòng)蛋白聚合。

AMOT負(fù)調(diào)節(jié)FSS誘導(dǎo)的PDL細(xì)胞中YAP轉(zhuǎn)運(yùn)

據(jù)報(bào)道,，AMOT家族可以與幾種Hippo 通路成分相互作用并調(diào)節(jié)YAP活性,。有趣的是，這些研究表明AMOT被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中,，其模式類似于FSS誘導(dǎo)的YAP定位,。AMOT N/C比相對(duì)于核厚度較高。FSS在5-10分鐘內(nèi)抑制AMOT的磷酸化,。當(dāng)沉默AMOT時(shí),，YAP核定位增加，對(duì)FSS沒(méi)有反應(yīng),。下游基因,，如CTGF和ANKRD1，表現(xiàn)出相同的趨勢(shì),。AMOT的敲低促進(jìn)了FSS誘導(dǎo)的PDL細(xì)胞增殖,。當(dāng)AMOT被沉默時(shí)，F(xiàn)SS加速增殖不受FSS調(diào)控,。這表明AMOT是一種負(fù)調(diào)節(jié)因子,，是FSS誘導(dǎo)的YAP核定位和細(xì)胞增殖所必需的。為了研究潛在的機(jī)制,，實(shí)驗(yàn)研究了AMOT與F-肌動(dòng)蛋白和YAP的相互作用,。結(jié)果表明，F(xiàn)SS可以增加AMOT與F-肌動(dòng)蛋白的結(jié)合并減少AMOT-YAP相互作用,。當(dāng)沉默YAP時(shí),，AMOT-F-肌動(dòng)蛋白相互作用在FSS下進(jìn)一步增強(qiáng)。當(dāng)通過(guò)Bleb抑制F-肌動(dòng)蛋白聚合時(shí),，AMOT-YAP相互作用得到促進(jìn),。當(dāng)使用Jasp時(shí)，在FSS下AMOT-YAP相互作用降低,。這些結(jié)果表明,，AMOT可以與F-actin和YAP競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。F-肌動(dòng)蛋白的聚合促進(jìn)了AMOT與F-肌動(dòng)蛋白的相互作用,。

為了進(jìn)一步研究AMOT的調(diào)控機(jī)制,，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)siYAP抑制了FSS介導(dǎo)的AMOT核定位（圖4 A、B）,。當(dāng)使YAP陰性調(diào)節(jié)因子LATS1/2沉默時(shí),，AMOT核定位增加并且對(duì)FSS沒(méi)有反應(yīng)（圖4 C、D）,。siLATS1/2也降低了它們的磷酸化（圖4 E）,，表明LATS1/2可以調(diào)節(jié)pAMOT和FSS誘導(dǎo)的核定位,。AMOT還可以調(diào)節(jié)LATS1的磷酸化。當(dāng)沉默AMOT時(shí),，F(xiàn)SS抑制的磷酸化進(jìn)一步下降,，并且不再受FSS調(diào)節(jié)（圖4 F）。這些結(jié)果表明,，F(xiàn)SS抑制pLATS1,，影響pAMOT及其核定位。AMOT可以磷酸化LATS1,。AMOT的核定位部分取決于YAP核轉(zhuǎn)運(yùn)（圖4 G）,。

圖4   YAP和LATS調(diào)節(jié)FSS誘導(dǎo)的AMOT磷酸化和定位。

（G）FSS如何調(diào)節(jié)p38并進(jìn)一步影響YAP核易位以促進(jìn)PDL細(xì)胞增殖的示意圖,。

在這項(xiàng)研究中,，報(bào)道了FSS可以通過(guò)p38-AMOT-YAP促進(jìn)PDL細(xì)胞增殖。FSS激活p38,，抑制pLATS并上調(diào)YAP活性,。此外，F(xiàn)SS誘導(dǎo)的p38表達(dá)還激活了Akt和pcofilin,，促進(jìn)了肌動(dòng)蛋白帽和F-肌動(dòng)蛋白聚合,，使細(xì)胞核變平，擴(kuò)增了核孔徑,，從而增加了YAP核易位,。F-肌動(dòng)蛋白招募AMOT進(jìn)行結(jié)合并從YAP-AMOT復(fù)合物中釋放YAP。研究結(jié)果表明,，F(xiàn)SS是PDL細(xì)胞擴(kuò)增的有前途的工具,，還揭示了YAP機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制，這將有利于未來(lái)的牙齒再生,。

參考文獻(xiàn)：Shi Q, Zheng L, Na J, Li X, Yang Z, Chen X, Song Y, Li C, Zhou L, Fan Y. Fluid shear stress promotes periodontal ligament cells proliferation via p38-AMOT-YAP. Cell Mol Life Sci. 2022 Oct 16;79(11):551. doi: 10.1007/s00018-022-04591-w. PMID: 36244032.

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