椎間盤退行性病變（DDD）是腰痛的重要病因,。DDD的發(fā)病機制復(fù)雜,，包括機械負荷過大、創(chuàng)傷,、炎癥,、遺傳,、衰老,、肥胖、營養(yǎng)不良等,。椎間盤（IVD）纖維環(huán)（AF）的物理損傷是脊柱退行性改變的重要原因,。過度的機械拉伸會改變AF細胞的數(shù)量和表型，從而降低AF的彈性,，導(dǎo)致IVD進一步損傷和退化,。此外,，AF細胞具有祖細胞的特性，可以在體外和體內(nèi)分化為軟骨細胞和成骨細胞,。因此，研究AF細胞上成骨的信號通路對于闡明DDD的發(fā)病機制非常重要,。

BMPs（人骨形態(tài)發(fā)生蛋白）是轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）超家族的成員，具有誘導(dǎo)干細胞分化為成骨細胞并促進骨形成的潛力,。BMP-2及其I型和II型受體的表達已在小鼠IVD的纖維細胞中觀察到。BMP-2/4及其I型和II型受體在50周齡衰老加速小鼠AF內(nèi)的纖維軟骨細胞中強烈表達,，因此似乎與IVD的變性有關(guān)。到目前為止,，許多研究已經(jīng)使用包含兩個BMP基因的異源二聚體配體來闡明BMP異源二聚體的廣泛生物學(xué)作用,，并且不同BMP配體的共表達可導(dǎo)致異源二聚體配體的形成。然而,，BMP-2/6異源二聚體在IVD變性的發(fā)病機制中的作用尚未得到很好的研究。

因此,，國立嘉義大學(xué)生化科學(xué)與技術(shù)系及食品科學(xué)系、成功大學(xué)醫(yī)院附設(shè)醫(yī)院骨科的一項聯(lián)合研究的目的是確定BMP-2/6異源二聚體在IVD中的作用,，以及IVD中機械拉伸與成骨反應(yīng)之間的因果關(guān)系以及IVD變性的信號通路,。

HCS 上調(diào)人 AF 細胞中的成骨基因表達

為了測試循環(huán)拉伸是否可以啟動與IVD成骨相關(guān)的基因表達,，對人AF細胞進行培養(yǎng)并接受循環(huán)拉伸方案，其中輕度循環(huán)拉伸（LCS,，5%）或高度循環(huán)拉伸（HCS,，15%）持續(xù)不同時間（圖1）,。實驗檢測了HCS處理是否能夠在AF細胞中誘導(dǎo)Runx2、osterix和OPN表達,。結(jié)果表明，與對照和LCS處理的細胞相比,，受HCS刺激4 h的AF細胞顯著誘導(dǎo)Runx2、osterix,、OPN 的mRNA（圖1 A）和蛋白質(zhì)（圖1 B）表達增加。此外,，Runx2,、osterix,、OPN 的mRNA（圖1 C）和蛋白質(zhì)（圖1 D）水平測定的時間過程顯示，在HCS處理的AF細胞中，1小時內(nèi)升高,，并持續(xù)8小時,。

Runx2是成骨基因表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,，因此研究了Runx2是否可以調(diào)節(jié)HCS對AF細胞中osterix和OPN表達的影響,。結(jié)果表明,，用 Runx2 特異性 siRNA 預(yù)處理細胞可顯著抑制 HCS 誘導(dǎo)的 osterix 和 OPN 的mRNA 和蛋白質(zhì)在AF細胞中的表達,，這說明Runx2 參與 HCS 誘導(dǎo)的成骨。

圖1   HCS 上調(diào)人 AF 細胞中的成骨基因表達,。

BMP-2/6 異源二聚體介導(dǎo)拉伸誘導(dǎo)的成骨基因表達

BMPs是成骨分化的主要調(diào)節(jié)因子。因此,，實驗確定了HCS處理引發(fā)的成骨基因表達是否會通過上調(diào)人AF細胞中的BMPs而產(chǎn)生,。結(jié)果表明，與對照組相比,，經(jīng)HCS處理的AF細胞中BMP-2和BMP-6的mRNA表達顯著增加（圖2 A）。此外,，用針對BMP-2（Ab-BMP-2）和BMP-6（Ab-BMP-6）的中和抗體預(yù)處理的細胞顯著抑制了HCS對AF細胞中Runx2,、osterix和OPN基因（圖2 B）和蛋白質(zhì)（圖2 C）表達的上調(diào)作用,。在重組蛋白實驗中，BMP-2和BMP-6均不能上調(diào)Runx2和osterix的基因和蛋白表達,，而BMP-2/6在相同濃度下誘導(dǎo)Runx2和 osterix 的顯著表達,。這些結(jié)果可推測,，當BMP-2或BMP-6的濃度不足以誘導(dǎo)基因和蛋白質(zhì)表達時，BMP-2/6可有效誘導(dǎo)Runx2和osterix表達,。

圖2   BMP-2/6異源二聚體介導(dǎo)拉伸拉伸誘導(dǎo)的成骨基因表達,。

HCS 誘導(dǎo)的 Runx2 表達依賴于 p38 MAPK

MAPK通路已被證明可以調(diào)節(jié)許多細胞過程,，包括成骨基因表達,。為了研究MAPKs參與HCS誘導(dǎo)調(diào)節(jié)Runx2表達的情況,，在HCS刺激之前和期間用MAPKs的特異性抑制劑（用于ERK的PD98059，用于JNK的SP600125,，用于p38的SB203580）處理人AF細胞1小時,。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SB203580可顯著抑制HCS誘導(dǎo)的Runx2 基因（圖3 A）和蛋白質(zhì)（圖3 B）表達,。HCS誘導(dǎo)后AF細胞中p38的磷酸化迅速增加，在1-2小時達到zui大水平（圖3 C）,。此外,，與對照和LCS處理的細胞相比，受HCS刺激1小時的細胞顯著誘導(dǎo)AF細胞中的p38磷酸化,。

圖3   HCS 誘導(dǎo)的 Runx2 表達依賴于 p38 MAPK。

SAMD1/5/8 參與循環(huán)拉伸誘導(dǎo)的 Runx2 表達

將BMP信號傳輸?shù)郊毎怂璧腟MAD蛋白已被證明可以誘導(dǎo)成骨基因表達,。實驗研究了SMAD1/5/8是否可以調(diào)節(jié)HCS誘導(dǎo)的人AF細胞中的Runx2表達。結(jié)果表明,，與對照相比,，HCS處理的AF細胞的在1小時內(nèi)顯著誘導(dǎo)SMAD1/5/8 的磷酸化，并持續(xù)8小時（圖4 A）,。與對照和LCS處理的細胞相比，由HCS刺激4小時的人AF細胞顯著誘導(dǎo)SMAD1/5/8的磷酸化（圖4 B）,。用SMAD1特異性siRNA預(yù)處理細胞顯著抑制HCS處理誘導(dǎo)的Runx2 mRNA（圖4 C）和蛋白質(zhì)（圖4 D）表達,。

圖4   SAMD1/5/8參與HCS誘導(dǎo)的Runx2表達,。

抑制 ALK3 受體降低循環(huán)拉伸誘導(dǎo)的成骨基因表達

據(jù)報道,，BMP-2/6異源二聚體可以結(jié)合和激活A(yù)LK3受體，并進一步影響宿主細胞基因的表達,。為了評估ALK3在HCS刺激的AF細胞成骨表型中的作用,，實驗評估了ALK3-siRNA和抑制劑（LDN）對HCS誘導(dǎo)的人AF細胞中Runx2和osterix表達的影響。結(jié)果表明,，HCS誘導(dǎo)的Runx2和osterix的mRNA表達通過ALK3-siRNA或LDN處理顯著降低（圖5 A）。此外,，HCS誘導(dǎo)的Runx2和osterix的蛋白表達在用LDN預(yù)處理的AF細胞中也被抑制（圖5 B）,。此外,，在用LDN預(yù)處理的細胞中,，由rhBMP-2/6 異源二聚體刺激的Runx6 mRNA表達在AF細胞中受到顯著抑制（圖5 C）。

圖5   抑制ALK3受體可降低HCS誘導(dǎo)的成骨基因表達,。

IVD 損傷患者的成骨基因表達

圖6 表現(xiàn)為IVD損傷患者手術(shù)切除組織中的成骨基因表達。退行性IVD和LF組織均表現(xiàn)出成骨表型,，這通過Runx2（圖6 A）,、osterix（圖6 B）和 OPN （圖6 C）的mRNA表達的增加證實,。成骨基因在AF組織中的表達水平高于黃韌帶（LF）組織,。

圖6   IVD 損傷患者的成骨基因表達。

圖7   影響人 AF 細胞中 15% 循環(huán)拉伸誘導(dǎo)的 BMP-2/6 表達和隨后的成骨調(diào)控的可能機制的示意圖,。

總之,，該研究結(jié)果提供了有關(guān)HCS誘導(dǎo)人AF細胞成骨基因表達的機制的信息。研究發(fā)現(xiàn),，用HCS刺激人AF細胞導(dǎo)致BMP-2/6異二聚體介導(dǎo)的信號通路的激活,。抑制ALK3活性可能是控制AF細胞成骨的有效方法,。HCS還誘導(dǎo)p38 MAPK和SMAD1/5/8信號通路的激活，并最終增強Runx2和osterix在人AF細胞中的表達,。此外,，還發(fā)現(xiàn)人類退行性IVD組織比LF組織具有更高的成骨基因表達,。這些發(fā)現(xiàn)為人類AF細胞中機械拉伸和細胞信號傳導(dǎo)相互作用的機制提供了見解，這可能參與DDD的進展,，并可用于DDD患者IVD變性的未來治療干預(yù)。

參考文獻：Chen CN, Chang HI, Yen CK, Liu WL, Huang KY. Mechanical Stretch Induced Osteogenesis on Human Annulus Fibrosus Cells through Upregulation of BMP-2/6 Heterodimer and Activation of P38 and SMAD1/5/8 Signaling Pathways. Cells. 2022 Aug 20;11(16):2600. doi: 10.3390/cells11162600. PMID: 36010676; PMCID: PMC9406707.

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