肌腱是機械敏感組織,，具有高度組織的膠原蛋白結(jié)構(gòu)，連接肌肉和骨骼,，并在運動過程中充當(dāng)力傳遞器,。肌腱細(xì)胞是肌腱的主要功能細(xì)胞,，嵌入膠原纖維束中，通過感知和響應(yīng)生物力學(xué)信號,，負(fù)責(zé)維持肌腱穩(wěn)態(tài)和生物力學(xué)特性,。

Tenomodulin（Tnmd，腱調(diào)蛋白）是一種II型跨膜糖蛋白,，已被確定為肌腱成熟特異分子標(biāo)志,，在干細(xì)胞/祖細(xì)胞（TSPC）增殖、分化和衰老中起重要作用,。Tnmd缺失的TSPCs也被證明表現(xiàn)出嚴(yán)重的遷移缺陷,。此外，Tnmd已被確定為在發(fā)育和成年肌腱中誘導(dǎo)的機械敏感基因,，其在肌腱中的表達與力強度相關(guān),。

細(xì)胞質(zhì)中生物力學(xué)信號的感知和翻譯高度依賴于細(xì)胞骨架。特別是,，肌動蛋白細(xì)胞骨架在對機械刺激產(chǎn)生協(xié)調(diào)和定向的細(xì)胞反應(yīng)中起著機械調(diào)節(jié)作用,。此外，有研究表明,，肌動蛋白細(xì)胞骨架介導(dǎo)的染色質(zhì)組織參與了力誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄,，但該通路是否參與調(diào)節(jié)生物力學(xué)誘導(dǎo)的Tnmd表達還有待證明。

重慶大學(xué)生物流變科學(xué)與技術(shù)教育部重點實驗室,、重慶郵電大學(xué)生物信息學(xué)院的一項研究探討了循環(huán)機械拉伸對Tnmd表達的影響,，揭示了Tnmd在拉伸誘導(dǎo)的肌腱細(xì)胞遷移中的作用。此外還探索了導(dǎo)致Tnmd表達和肌腱細(xì)胞遷移的潛在機械轉(zhuǎn)導(dǎo)機制,，重點是肌動蛋白細(xì)胞骨架介導(dǎo)的染色質(zhì)組織,。

機械拉伸誘導(dǎo)肌腱細(xì)胞中Tnmd表達和細(xì)胞遷移

為了確認(rèn)Tnmd在肌腱組織和細(xì)胞中的表達，對Tnmd進行mRNA和蛋白質(zhì)分析,，與肌腱組織相比,，培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞中的Tnmd顯著降低（圖1 A、B）,。接下來,，分析Tnmd在加載單軸循環(huán)拉伸（10%，0.5Hz,，1小時）的肌腱細(xì)胞中的基因和蛋白表達,。結(jié)果表明，與未拉伸的肌腱細(xì)胞相比,，Tnmd在mRNA（圖1 C）和蛋白質(zhì)（圖1 D,、E）處的表達水平較高。此外,，檢測機械拉伸下肌腱細(xì)胞的遷移行為,。數(shù)據(jù)顯示,，負(fù)載的肌腱細(xì)胞遷移顯著增加（圖1 F、G）,。這些結(jié)果可推斷機械拉伸誘導(dǎo)的Tnmd表達與肌腱細(xì)胞遷移之間可能存在關(guān)聯(lián),。

圖1 拉伸上調(diào)培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞中Tnmd表達和細(xì)胞遷移。

（A）RT-qPCR檢測TnmdmRNA表達水平,。（B）免疫印跡檢測肌腱組織和培養(yǎng)肌腱細(xì)胞中Tnmd蛋白水平,。（C-E）分別采用RT-qPCR、WB和免疫熒光分析Tnmd在拉伸的肌腱細(xì)胞中的基因和蛋白表達,。（F）測定遷移性肌腱細(xì)胞,。（G）對遷移率進行了量化。

拉伸增加的Tnmd調(diào)節(jié)肌腱細(xì)胞的遷移

為了進一步研究Tnmd是否可以直接調(diào)節(jié)肌腱細(xì)胞遷移,，實驗利用sh-RNA敲低Tnmd后測定肌腱細(xì)胞的遷移能力,。與對照沉默組（pLKO.1）相比，Tnmd敲低組（sh-Tnmd1和sh-Tnmd2）Tnmd的mRNA和蛋白顯著降低（圖2 A,、B）,。此外，拉伸刺激的肌腱細(xì)胞組表現(xiàn)出比機械拉伸刺激的Tnmd敲低肌腱細(xì)胞組更高的Tnmd表達（圖2 C,、D）,。而且暴露于機械拉伸刺激的Tnmd敲低肌腱細(xì)胞組中肌腱細(xì)胞的遷移也顯著減少（圖2 E、F）,。這些發(fā)現(xiàn)表明,，肌腱細(xì)胞將機械力轉(zhuǎn)化為促進肌腱細(xì)胞遷移的Tnmd信號。

圖2 拉伸通過增加的Tnmd表達來增強肌腱細(xì)胞遷移,。

（A,、B）RT-qPCR和WB檢測TnmdmRNA和蛋白質(zhì)表達。肌腱細(xì)胞被表示為“pLKO.1",，并感染慢病毒-shcontrol,。肌腱細(xì)胞被表示為“sh-Tnmd"并干擾靶向Tnmd的慢病毒,。使用兩個獨立的TnmdshRNA,，分別表示為sh-Tnmd1和sh-Tnmd2。（C,、D）通過WB檢測Tnmd和GAPDH（拉伸對照）的蛋白表達,。（E）檢測遷移性肌腱細(xì)胞。（F）對遷移進行計數(shù)和量化,。

拉伸增強的肌動蛋白應(yīng)力纖維增加Tnmd表達和肌腱細(xì)胞遷移

肌動蛋白細(xì)胞骨架對于細(xì)胞內(nèi)的快速機械信號傳遞至關(guān)重要,。為了探索肌動蛋白細(xì)胞骨架在拉伸誘導(dǎo)的Tnmd和肌腱細(xì)胞遷移中的可能作用，實驗評估了機械拉伸對F-肌動蛋白細(xì)胞骨架組織的響應(yīng),。與未拉伸組相比,，拉伸的肌腱細(xì)胞表現(xiàn)出增厚的肌動蛋白應(yīng)力纖維（圖3 A,、B）。為進一步研究肌動蛋白應(yīng)力纖維對拉伸誘導(dǎo)的Tnmd表達和肌腱細(xì)胞遷移的影響,，用抑制肌動蛋白聚集藥物L(fēng)atA（0.5μM）預(yù)孵育后檢測Tnmd表達和肌腱細(xì)胞遷移,，LatA可以有效破壞肌動蛋白應(yīng)力纖維的形成（圖3 C、D）,。結(jié)果發(fā)現(xiàn),，與沒有LatA的拉伸肌腱細(xì)胞相比，在LatA存在下暴露于拉伸的肌腱細(xì)胞表現(xiàn)出較低的Tnmd表達,。此外,，在受拉伸的細(xì)胞中，肌腱細(xì)胞遷移增加,，而在LatA存在下拉伸的細(xì)胞顯示肌腱細(xì)胞遷移顯著減少（圖3 F,、G）。

此外,，考慮到Rho相關(guān)的卷曲蛋白激酶（ROCK）是肌動蛋白應(yīng)力纖維的特異性因子,，因此評估了ROCK抑制劑Y27632對拉伸增加的Tnmd表達和肌腱細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果表明,，使用Y27632抑制肌動蛋白應(yīng)力纖維可消除拉伸誘導(dǎo)的Tnmd表達和肌腱細(xì)胞遷移,。這些結(jié)果表明，肌動蛋白應(yīng)力纖維對于誘導(dǎo)拉伸細(xì)胞中的Tnmd表達和肌腱細(xì)胞遷移很重要,。

圖3 肌動蛋白應(yīng)力纖維的增厚有助于拉伸肌腱細(xì)胞中的Tnmd表達和肌腱細(xì)胞遷移,。

（A、C）通過鬼筆環(huán)肽染色檢測F-肌動蛋白組織,，用DAPI（藍(lán)色）對細(xì)胞核進行染色,。右列是左側(cè)原始圖像綠色邊框的部分放大視圖。（B,、D）用應(yīng)力纖維增厚（SFTI）評估和量化F-肌動蛋白細(xì)胞骨架重塑,。（E）WB用于分析Tnmd蛋白的表達。（F）檢測遷移性肌腱細(xì)胞,。（G）對遷移進行計數(shù)和量化,。

拉伸誘導(dǎo)的染色質(zhì)解聚增加Tnmd表達和肌腱細(xì)胞遷移

為了確定染色質(zhì)組織是否由機械刺激介導(dǎo)，實驗評估了拉伸細(xì)胞中染色質(zhì)凝聚的狀態(tài),。DNaseI敏感位點（DHS）具有可接近染色質(zhì)特征,。結(jié)果表明，在沒有DNaseI（脫氧核糖核酸酶I）的情況下進行拉伸的細(xì)胞的核區(qū)域與未拉伸組的細(xì)胞核區(qū)域沒有區(qū)別（圖4 A,、B）,。然而，DNaseI處理導(dǎo)致拉伸細(xì)胞中的核面積比未拉伸的細(xì)胞?。▓D4 A,、B）,，表明機械拉伸導(dǎo)致染色質(zhì)解聚。

接下來,，確定了染色質(zhì)解聚是否與拉伸誘導(dǎo)的Tnmd表達和遷移有關(guān),。兩種特異性藥物組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑（ANA）和去甲基化酶抑制劑（GSK-J4）用于抑制染色質(zhì)解聚。結(jié)果表明,，與沒有抑制劑的拉伸細(xì)胞相比,，ANA或GSK-J4處理的拉伸肌腱細(xì)胞中染色質(zhì)凝聚增加（圖4 C、D）,。

為了確定處于凝縮狀態(tài)的染色質(zhì)對拉伸誘導(dǎo)的Tnmd表達和肌腱細(xì)胞遷移的影響,，將肌腱細(xì)胞與ANA或GSK-J4預(yù)孵育1h，然后用拉伸刺激,。結(jié)果表明,，在染色質(zhì)解聚抑制劑ANA和GSK-J4存在下暴露于拉伸的肌腱細(xì)胞在mRNA水平上Tnmd的表達較低（圖4 E）。此外發(fā)現(xiàn),，與拉伸的肌腱細(xì)胞相比,，在ANA處理的拉伸細(xì)胞或GSK-J4處理的拉伸細(xì)胞中，Tnmd蛋白表達和肌腱細(xì)胞遷移被消除（圖4 F-H）,。這些結(jié)果表明,，組蛋白甲基化和乙酰化引起的染色質(zhì)解聚可能有助于拉伸誘導(dǎo)的Tnmd表達和肌腱細(xì)胞遷移,。

圖4 解凝染色質(zhì)有助于拉伸肌腱細(xì)胞中的Tnmd表達和腱細(xì)胞遷移,。

（A、C）通過原位DNaseI靈敏度檢測染色質(zhì)凝聚,。（B,、D）用核面積評估和量化染色質(zhì)凝聚的程度。（E）TnmdmRNA表達的RT-qPCR檢測,。（F）WB用于分析Tnmd蛋白的表達,。（G）檢測遷移性肌腱細(xì)胞。（H）對遷移進行計數(shù)和量化,。

綜上所述,，該研究結(jié)果表明，肌動蛋白應(yīng)力纖維的形成和染色質(zhì)解聚可調(diào)節(jié)Tnmd表達,，從而可能調(diào)節(jié)肌腱細(xì)胞遷移,。因此,，該研究提出了肌動蛋白和染色質(zhì)機械轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與Tnmd調(diào)控,，并揭示了Tnmd在肌腱細(xì)胞遷移中的新作用。Tnmd在肌腱細(xì)胞遷移中的功能鑒定為Tnmd介導(dǎo)的肌腱修復(fù)所涉及的分子機制提供了見解,。

參考文獻：

Xu P, Deng B, Zhang B, Luo Q, Song G. Stretch-Induced Tenomodulin Expression Promotes Tenocyte Migration via F-Actin and Chromatin Remodeling. Int J Mol Sci. 2021 May 6;22(9):4928. doi: 10.3390/ijms22094928. PMID: 34066472; PMCID: PMC8124537.

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