骨關節(jié)炎（OA）是一種慢性退行性關節(jié)疾病,，會破壞關節(jié)軟骨,。生物力學因素在OA的發(fā)病機制中起重要作用,。顳下頜關節(jié)（TMJ）在生物力學上與牙齒咬合有關,，是OA損傷的多發(fā)部位。

第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)學院,、南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院,、廣東省細胞微環(huán)境與疾病研究重點實驗室及美國拉什大學醫(yī)學中心骨科的一項聯(lián)合研究曾報道了流體剪切應力（FFSS）在體外誘導TMJ軟骨細胞死亡。此外還開發(fā)了一種稱為單側前交叉（UAC）的體內異常牙齒咬合模型,，并證明它誘導大鼠和小鼠顳下頜關節(jié)軟骨中的軟骨細胞死亡和OA樣病變,。這些體外和體內模型有助于研究異常生物力學誘導軟骨細胞死亡和顳下頜骨關節(jié)炎發(fā)作的分子機制。然而,，UAC是否可以誘導TMJ OA軟骨中的內質網應激（ERS）凋亡仍未知,。

細胞暴露于廣泛的負荷會導致鈣過載和ER腔中錯誤折疊蛋白質的積累，稱為ER應激（ERS）,。該ERS由三種ER跨膜蛋白檢測,，包括EIF2AK3（真核翻譯起始因子2α激酶3），ERN1 / IRE1（內質網到核信號轉導1）和ATF6（激活轉錄因子6）,。自噬是一種細胞自我消化過程,，并且與ERS密切相關。它決定了細胞內細胞器和蛋白質的周轉,，被認為是OA中細胞存活的重要機制,。

MTOR（哺乳動物雷帕霉素靶蛋白）是一種高度保守的蛋白激酶，形成兩種不同的功能復合物,，即MTOR復合物1（MTORC1）和MTORC2,。MTORC1是雷帕霉素的敏感靶標，被TSC1/2（結節(jié)性硬化癥復合體1/2）抑制,，TSC1/2是自噬的負調節(jié)因子,，可作為MTORC1的上游抑制因子，以降低小鼠實驗性OA的嚴重程度,。據報道,，雷帕霉素激活自噬可防止人軟骨細胞出現OA樣病變和OA小鼠模型中的延遲關節(jié)軟骨退化。

在這項研究中,，該團隊使用先前建立的體內和體外模型以及兩個遺傳小鼠模型,，研究了自噬和ERS凋亡是否都參與生物力學誘導的TMJ OA病變的進展。此外,，進一步研究了在TMJ OA進展中,，MTORC1是否在軟骨細胞中將ERN1介導的自噬通量轉換為EIF2AK3介導的ERS的凋亡程序中發(fā)揮作用。

首先,，實驗表明了,，UAC在顳下頜關節(jié)OA進展的整個過程中誘導ERS凋亡，同時在早期誘導自噬,，但在晚期抑制自噬,。MTORC1是一種自噬抑制劑，在早期被抑制,，但在晚期被激活,，這表明它在UAC誘導的TMJ OA軟骨病變的進展中在將自噬轉變?yōu)镋RS凋亡中發(fā)揮作用,。

接下來，利用體外流動剪切應力（FFSS）模型系統(tǒng)來確定機械力對ATDC5軟骨細胞樣細胞中ERS凋亡和自噬途徑的影響,。結果表明,，FFSS對軟骨細胞中的鈣內流和ERS有影響。

然后研究了FFSS是否誘導ATDC5細胞中的ERS凋亡和自噬,。細胞用FFSS（24 dyne/cm2）處理1,、2和4小時。結果顯示,，未經FFSS處理的ATDC5細胞呈多邊形,，具有大且未濃縮的細胞核，其ER連續(xù)且緊湊,，細胞質中的囊泡很少,。FFSS導致ATDC5細胞中ER的擴增，隨著時間的推移而加劇,。還觀察到含有不wan全消化的細胞器和溶酶體酶顆粒,，特別是在處理1和2小時。

通過qPCR分析和蛋白質印跡顯示,，TUNEL陽性細胞的數量增加,，CASP12和DDIT3在FFSS處理的細胞中的表達水平上調，HSPA5和p-EIF2AK3的表達水平在1至4小時水平上調,。然而,，p-ERN1、BECN1和LC3B-II的表達水平在1和2 h時升高,，但在4 h時沒有增加,。p-MTOR和p-RPS6的表達水平在1和2 h時降低，但在4 h時沒有降低（圖1 a,、b）,，而SQSTM1水平在1和2 h時降低，但在4 h時升高,。LAMP2的表達水平在整個時間過程中升高（圖1 c）,。IF染色結果顯示，LC3B-II和LAMP2在1和2 h時共定位點增加,，但4小時沒有增加（圖1 d）,。巴佛洛霉素A1抑制自噬體與溶酶體融合，在2 h時增加LC3B-II的表達水平,，但4 h不增加,，且不影響p-MTOR和p-RPS6的表達（圖1 e、f）,。

這些結果表明,，FFSS在整個實驗過程中激活ERS細胞凋亡,，在早期激活自噬通量，但在后期抑制自噬通量,，MTORC1可能參與這一過程的調節(jié),。

圖1   FFSS激活自噬通量，但使培養(yǎng)的ATDC5細胞中的MTORC1通路失活

（a）ATDC5細胞暴露于24 dyne/cm2 的FFSS于zhi定時間,，蛋白質印跡用于測量蛋白質表達。（b）（a）的定量數據,。（c）蛋白質印跡法檢測 SQSTM1/p62 和 LAMP2 的蛋白表達,，用于檢測自噬通量。（d）ATDC5細胞按（a）中處理,。IF染色用于定位自噬體和溶酶體,。（e）用巴佛洛霉素A1 和FFSS 刺激 2 和 4 小時處理的 ATDC5 細胞的 IF 染色。（f）蛋白質印跡法用于 ATDC5 細胞中的蛋白質表達,，這些細胞經受 24 dyne/cm2 FFSS 2 和 4 小時,，有或沒有巴佛洛霉素A1處理。

MTORC1促進p-EIF2AK3介導的ERS凋亡,，但抑制FFSS處理的軟骨細胞中的自噬通量

為了研究MTORC1下游靶點EIF2AK3是否在軟骨細胞中FFSS誘導的ERS凋亡和自噬程序中發(fā)揮作用,，實驗在培養(yǎng)基中加入p-EIF2AK3抑制劑GSK2606414進行2和4小時FFSS處理實驗。結果表明,，GSK2606414降低了FFSS增加的CASP12,、DDIT3和p-EIF2AK3表達以及TUNEL陽性細胞，促進了LC3B-II和LAMP2的共定位,，降低了SQSTM1的表達,。它不影響p-MTOR、p-RPS6,、HSPA5和p-ERN1的表達,，并且在2小時時沒有逆轉FFSS增加的LC3B-II和BECN1表達，盡管它在4小時抑制了LC3B-II的表達,。

接下來研究了MTORC1是否在FFSS誘導的ERS凋亡和自噬中發(fā)揮作用,，方法是在2和4小時或1和2小時FFSS刺激之前，在ATDC5細胞培養(yǎng)基中添加雷帕霉素（MTORC1的抑制劑）或MHY1485（MTORC1的激活劑）,。結果表明,，雷帕霉素處理在2和4 h抑制了FFSS處理的ATDC5細胞中p-MTOR和p-RPS6的表達水平，并降低了FFSS刺激的細胞凋亡和p-EIF2AK3,、CASP12和DDIT3表達,。MTORC1激活劑MHY1485表現出相反的效果。

總的來說,，這些結果表明MTORC1通過上調抑制自噬體-溶酶體融合的p-EIF2AK3來抑制自噬體形成的啟動并促進ERS凋亡,。

p-ERN1抑制MTORC1以減弱FFSS處理的軟骨細胞中的ERS凋亡

為了進一步研究ERN1在ERS凋亡和自噬過程中調節(jié)MTORC1中的作用,，ATDC5細胞感染表達ERN1的慢病毒，并在存在或不存在MHY1485的情況下進行4小時FFSS,。結果表明,，ERN1過表達抑制p-MTOR和p-RPS6的表達，上調BECN1和LC3B-II并促進軟骨細胞自噬,，但下調p-EIF2AK3,、CASP12和DDIT3，抑制FFSS誘導的軟骨細胞凋亡,，而不影響HSPA5表達（圖2 a-f）,。MHY1485逆轉了ERN1抑制的p-MTOR和p-RPS6的表達，抑制自噬,，促進ERS凋亡,，而不影響HSPA5表達（圖2 d-f）。有趣的是,，p-PRKAA1/2（蛋白激酶）在體內4周UAC組中上調,，在體外2小時FFSS組上調（圖2 g-i）。A769662激活p-PRKAA1/2逆轉了4μ8C（p-ERN1的抑制劑）對自噬的抑制作用（圖2 h,、i）,。這些結果表明，p-ERN1通過p-PRKAA1/2（AMPK）途徑抑制MTORC1來抑制FFSS處理的軟骨細胞中ERS凋亡,，但促進自噬,。

圖2   p-ERN1抑制MTORC1以減弱FFSS處理的軟骨細胞中的ERS凋亡

（A-F）ATDC5細胞用4μ8C（1 μM）、雷帕霉素（100 nM）,，4μ8C（1 μM）+雷帕霉素（100 nM）,，ERN1慢病毒感染（ACT）或ACT + MHY1485（100 nM）處理。兩小時后,，對細胞進行FFSS（24 dyne/cm2）4小時,，然后進行蛋白質印跡（a、b,、d,、e）和qPCR分析（c）以表達指示基因，或TUNEL染色以表達細胞凋亡（f）,。（g） 在 4 周和 8 周使用針對 p-PRKAA1/2 的抗體進行 IHC 染色,。（H、I）用1 μM 4μ8C或1 μM A769662處理或兩者對ATDC5細胞中的指示標志物進行蛋白質印跡分析,。

抑制MTORC1促進自噬并抑制UAC刺激的顳下頜關節(jié)軟骨細胞的凋亡

通過刪除小鼠MTORC1表達,，進一步確定了MTORC1失活對UAC誘導的顳下頜關節(jié)軟骨軟骨自噬和細胞凋亡的影響。數據表明,，在假手術組中,，MTORC1缺失降低了軟骨細胞中p-RPS6蛋白的水平,，并增加了safranin O染色顯示的基質量。MTORC1的缺失激活了自噬程序,，如BECN1和LC3B-II表達的增加以及LC3B-II和LAMP2在軟骨細胞中的共定位所證明的那樣,。然而，它沒有顯著改變p-EIF2AK3,，裂解的CASP3,，CASP12，DDIT3和TUNEL陽性細胞數量的表達,。軟骨細胞中MTORC1的缺失顯著減少了UAC誘導的7周時顳下頜關節(jié)軟骨丟失,。重要的是，MTORC1活性的缺失顯著降低了UAC刺激的p-EIF2AK3,，裂解的CASP3，CASP12和DDIT3的表達水平以及TUNEL陽性細胞的數量增加,，但增加了BECN1和LC3B-II蛋白在UAC處理的軟骨中的表達水平（圖3 h-l）,，表明抑制MTORC1促進自噬并抑制UAC刺激的顳下頜關節(jié)軟骨細胞的凋亡。

圖3   MTORC1失活促進軟骨細胞自噬,，抑制軟骨細胞凋亡,，防止UAC下的軟骨丟失

（h）軟骨細胞中MTORC1的軟骨特異性缺失。小鼠接受UAC或假手術7周,，并按照材料和方法中所述注射TM,。IF染色：顳下頜關節(jié)矢狀中央切片用p-RPS6抗體染色（S235/236）。p-RPS6：紅色,；DAPI：藍色,。（i-l）（h）的量化。

通過注射MHY1485或Tsc1的基因缺失激活MTORC1抑制自噬并促進軟骨細胞凋亡,，并增強UAC誘導的TMJ軟骨丟失

實驗最終通過刪除軟骨細胞中MTORC1的上游負調節(jié)因子TSC1的表達來研究MTORC1的激活對UAC誘導的TMJ軟骨細胞自噬和凋亡的影響,。正如預期的那樣，在UAC-假手術組中,，Tsc1的缺失上調了軟骨細胞中p-RPS6蛋白的水平,，增加p-EIF2AK3、CASP12,、DDIT3和裂解CASP3的表達,，但降低BECN1和LC3B-II的表達，抑制LC3B-II和LAMP2的共定位,，降低軟骨基質量,。在UAC處理組中，Tsc1的缺失逆轉了UAC抑制的p-RPS6表達,，并進一步上調了UAC刺激的p-EIF2AK3,、CASP12,、DDIT3和裂解CASP3的表達，但降低了UAC刺激的BECN1和LC3B-II的表達,，并增強了UAC誘導的OA樣表型,，包括關節(jié)軟骨的急劇丟失和顳下頜關節(jié)軟骨中蛋白多糖數量的減少?？偟慕Y果表明,，通過注射MHY1485或Tsc1的基因缺失激活MTORC1抑制自噬并促進軟骨細胞凋亡，并增強UAC誘導的TMJ軟骨丟失,。

圖4   工作模型表明了MTORC1在ERS凋亡和自噬通量之間的串擾中的作用

UAC-FFSS誘導鈣過載,，并通過上調p-EIF2AK3和p-ERN1來促進ERS。自噬通量由ERN1-MTORC1信號啟動,，ERS凋亡由軟骨細胞中的MTORC1-EIF2AK3誘導,。MTORC1，p-ERN1-p-PRKAA1/2 （AMPK） 的下游,，通過上調 p-EIF2AK3 響應于長時間的異常生物力學負荷,，將軟骨細胞的自噬切換到 ERS-凋亡，這促進了 CASP12 和 DDIT3 的表達,，從而導致細胞凋亡并通過抑制自噬體-溶酶體融合來抑制自噬,。

綜上所述，該研究結果為MTORC1在LC3B-II介導的保護性自噬與p-EIF2AK3介導的軟骨細胞降解ERS凋亡以響應延長的異常生物力學負荷中的作用帶來了新的見解,?；罨?/span>p-EIF2AK3除了通過增加CASP12和DDIT3的表達促進細胞凋亡外，還通過抑制自噬體-溶酶體的形成來抑制自噬,。研究的結果通過ERN1-MTORC1-EIF2AK3信號通路的干預為OA提供了潛在的治療靶點,。

參考文獻：Yang H, Wen Y, Zhang M, Liu Q, Zhang H, Zhang J, Lu L, Ye T, Bai X, Xiao G, Wang M. MTORC1 coordinates the autophagy and apoptosis signaling in articular chondrocytes in osteoarthritic temporomandibular joint. Autophagy. 2020 Feb;16(2):271-288. doi: 10.1080/15548627.2019.1606647. Epub 2019 Apr 21. PMID: 31007149; PMCID: PMC6984599.

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