動脈粥樣硬化是一種大動脈疾病，其發(fā)病機(jī)制的起始步驟是血管內(nèi)皮屏障功能障礙,。覆蓋在內(nèi)皮細(xì)胞表面的糖萼是維持內(nèi)皮和血管功能的非常關(guān)鍵的“器官",。越來越多的證據(jù)表明，內(nèi)皮糖萼不完整性導(dǎo)致血管系統(tǒng)對致動脈粥樣硬化和炎癥的敏感性增加,。作為糖萼的主要成分,，透明質(zhì)酸（HA）可以微調(diào)細(xì)胞行為，能監(jiān)測和放大內(nèi)皮細(xì)胞膜上的流動引起的剪切應(yīng)力,。

活性氧（ROS）不僅對糖萼構(gòu)成直接威脅,，而且還可以通過激活基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和內(nèi)源性蛋白酶抑制劑的失活來增強(qiáng)糖萼的蛋白水解，可以降解膠原蛋白,，透明質(zhì)酸和層粘連蛋白,，所有這些都是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的主要組成部分，導(dǎo)致糖萼層的根本破壞,。

低剪切應(yīng)力（LSS）會導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生過多,，超過系統(tǒng)的局部抗氧化能力，進(jìn)而導(dǎo)致糖萼降解,。顯然,，低剪切應(yīng)力刺激和氧化應(yīng)激之間存在惡性循環(huán)，兩者協(xié)同作用可能會使糖萼退化,。但是,，低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙的發(fā)病機(jī)制在很大程度上仍不清楚。

小檗堿（BBR）也叫黃連素,，是從中藥黃連中分離出來的一種生物堿,，具有多種藥理和生物學(xué)活性，例如抗菌活性,、抗炎,、抗氧化應(yīng)激和心臟保護(hù)作用。先前的研究表明,，低剪切應(yīng)力通過增加p47 ^phox的磷酸化以及增加的活性氧產(chǎn)生來損害糖萼,。然而，低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的糖萼降解和小檗堿之間的相互作用,，以及小檗堿對低剪切應(yīng)力損傷的內(nèi)皮的保護(hù)作用的機(jī)制,，仍然未知。

因此,，江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,、南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科、揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科的一項(xiàng)聯(lián)合研究旨在探索小檗堿是否減弱了細(xì)胞和動物模型中低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的糖萼降解,，并闡明了潛在的分子機(jī)制,。

小檗堿改善低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的透明質(zhì)酸降解

低剪切應(yīng)力可以促進(jìn)透明質(zhì)酸的降解,，其降解可以促進(jìn)炎癥反應(yīng)。相反,，小檗堿已被證明在抑制炎癥方面起著關(guān)鍵作用,。因此，實(shí)驗(yàn)決定確定小檗堿是否參與透明質(zhì)酸代謝的調(diào)節(jié),。首先,，將HUVECs暴露在設(shè)置的時(shí)間（0、5,、15,、30、60和120 min）的低剪切應(yīng)力（2?dyne/cm2）下,。免疫熒光分析顯示,，透明質(zhì)酸表達(dá)明顯降低，在暴露于低剪切應(yīng)力30 min時(shí)達(dá)到最小值（圖1）,。其次,，用不同劑量（0、5 μmol/l,、10 μmol/l和20 μmol/l）對HUVECs進(jìn)行預(yù)處理24 h,，然后暴露于低剪切應(yīng)力下，結(jié)果表明,，小檗堿降低了低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的透明質(zhì)酸降解,，且呈濃度依賴性（圖1 B）。

為了確定小檗堿降低體外透明質(zhì)酸降解的作用是否可以轉(zhuǎn)化到小鼠模型,，通過免疫熒光測量了透明質(zhì)酸的表達(dá)并量化了IHC載玻片,。結(jié)果表明，與對照組相比,，小檗堿處理顯著恢復(fù)了主動脈血管組織中透明質(zhì)酸的表達(dá)（圖1 C,、D）,。

圖1   小檗堿改善低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的HA降解

小檗堿抑制低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的NADPH氧化酶激活

作為活性氧的主要來源,，NADPH-氧化酶在血管細(xì)胞糖萼的代謝中起著至關(guān)重要的作用。以前的研究表明,，低剪切應(yīng)力和小檗堿對NADPH氧化酶的活性具有相反的影響,，其中低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)NADPH氧化酶激活，而小檗堿抑制NADPH氧化酶活化,。在這項(xiàng)研究中,，證實(shí)了低剪切應(yīng)力可以提高p47phox的磷酸化水平并在體外激活NADPH 氧化酶 2（NOX2）。此外,，還顯示低剪切應(yīng)力下內(nèi)皮細(xì)胞中p47phox的磷酸化水平顯著高于靜態(tài)組,。免疫共沉淀分析表明,，低剪切應(yīng)力增加了p47phox和NOX2的結(jié)合，這可能導(dǎo)致NADPH氧化酶的活化,。然而,，用小檗堿預(yù)處理后，p47phox磷酸化和NOX2活化都受到抑制,，p47phox和NOX2的結(jié)合也在體外降低,，伴隨著活性氧產(chǎn)生的減少。

有趣的是,，小檗堿處理導(dǎo)致p47phox 的基礎(chǔ)磷酸化水平升高,，但與對照組相比，當(dāng)暴露于低剪切應(yīng)力時(shí),，這種變化沒有進(jìn)一步增加,。小檗堿處理組和對照組的活性氧和NO的基礎(chǔ)水平都沒有明顯變化。同樣,，小檗堿不僅不增加細(xì)胞凋亡,，而且還減少低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

小檗堿抑制LSS誘導(dǎo)的Hyal2激活并調(diào)節(jié)p47phox和 Hyal2的串?dāng)_

作為調(diào)節(jié)HA代謝的主要酶,，透明質(zhì)酸氨基葡糖苷酶2（Hyal2）在HA消化中起著至關(guān)重要的作用,。體外蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光均顯示，暴露于低剪切應(yīng)力后,，Hyal2表達(dá)顯著增加（圖2 B,、E）。為了確定小檗堿是否也與Hyal2的激活有關(guān),，用小檗堿（5μM,、10μM、20μM）預(yù)處理細(xì)胞24小時(shí),，然后暴露于低剪切應(yīng)力,。蛋白質(zhì)印跡顯示，小檗堿抑制Hyal2活化（圖2 C,、D）,，免疫熒光分析也證明小檗堿可以降低Hyal2表達(dá)（圖2 E）。與p47phox磷酸化的變化類似,，體內(nèi)小檗堿預(yù)處理后Hyal2表達(dá)也降低（圖2 A）,。

此外，發(fā)現(xiàn)p47phox沉默后,，小檗堿未能進(jìn)一步抑制低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的Hyal2激活,，表明小檗堿通過調(diào)節(jié)p47phox抑制Hyal2的活性。同樣,，當(dāng) p47phox過表達(dá)時(shí),，小檗堿不能有效抑制Hyal2活化,；當(dāng)Hyal2沉默時(shí)，小檗堿也不能抑制低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的 p47phox 磷酸化,。此外,，發(fā)現(xiàn)小檗堿可以增加p47phox/Hyal2 的結(jié)合。

圖2   小檗堿抑制LSS誘導(dǎo)的Hyal2激活

小檗堿逆轉(zhuǎn)低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的AMPK去磷酸化

研究表明,，小檗堿對糖尿病和肥胖癥有益,，至少部分是通過調(diào)節(jié)AMPK活性。因此,，假設(shè)小檗堿可能會逆轉(zhuǎn)低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的AMPK磷酸化水平降低,。圖3 A表明，低剪切應(yīng)力降低了AMPK的磷酸化水平,。用小檗堿預(yù)處理后,，可以逆轉(zhuǎn)低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的AMPK去磷酸化（圖3 C）。為了證明小檗堿激活AMPK的功效,，用不同濃度的小檗堿（5μM,、10μM、20μM）預(yù)處理HUVECs 24小時(shí),，然后暴露于低剪切應(yīng)力,。蛋白質(zhì)印跡顯示，小檗堿可以以劑量依賴性方式顯著增加AMPK的磷酸化水平（圖3 B）,。

圖3   小檗堿通過逆轉(zhuǎn)低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的 AMPK 抑制抑制p47phox和 Hyal2 激活

小檗堿通過AMPK活化抑制HUVECs中p47phox 磷酸化和Hyal2活化

考慮到小檗堿恢復(fù)了低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的AMPK去磷酸化,，實(shí)驗(yàn)試圖確定小檗堿是否通過激活 AMPK減弱低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的p47phox磷酸化和 Hyal2 活化。結(jié)果表明,，在與小檗堿和化合物C（AMPK抑制劑）共同處理后,，低剪切應(yīng)力可以消除p47phox和Hyal2對小檗堿的響應(yīng)（圖3 D）。為了進(jìn)一步在小檗堿處理中連接 AMPK 與 p47phox和Hyal2,，通過敲低AMPKα1,，然后用小檗堿預(yù)處理24小時(shí)，在低剪切應(yīng)力下,，小檗堿不能抑制p47phox磷酸化和Hyal2活化（圖3 E-G）,。此外，實(shí)驗(yàn)確定了p47phox和Hyal2的結(jié)合是否也受到小檗堿處理的影響,。結(jié)果表明,，小檗堿降低了低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的p47phox/Hyal2 的解離（圖3 H）,。所有數(shù)據(jù)都顯示,，小檗堿通過 AMPK 激活抑制p47phox和 Hyal2的活化。

小檗堿逆轉(zhuǎn)HAS2的表達(dá)也依賴于AMPK活化

透明質(zhì)酸合酶-2（HAS2）是合成透明質(zhì)酸的關(guān)鍵酶,。在這項(xiàng)研究中,，蛋白質(zhì)印跡顯示,，低剪切應(yīng)力以時(shí)間依賴性方式下調(diào)HAS2表達(dá)，30min時(shí)HAS2表達(dá)最小,。然而,，小檗堿可以改善低剪切應(yīng)力降低的HAS2表達(dá)，且呈劑量依賴性,。

為了研究低剪切應(yīng)力降低HAS2表達(dá)的潛在機(jī)制至少部分是由于AMPK活性的變化,，實(shí)驗(yàn)用小檗堿和化合物C共同處理細(xì)胞，然后暴露于低剪切應(yīng)力,。蛋白質(zhì)印跡顯示,，小檗堿處理不能逆轉(zhuǎn)HAS2表達(dá)的降低，表明AMPK參與了HAS2表達(dá)的調(diào)節(jié),。此外,，在敲低AMPKα1的同時(shí)，HAS2表達(dá)的變化也不受小檗堿處理的影響,。相反,，通過過表達(dá)AMPKα1然后暴露于低剪切應(yīng)力，與對照組相比,，HAS2表達(dá)顯著增加,。這些結(jié)果表明，小檗堿通過AMPK通路調(diào)節(jié)HAS2活性,。

然而沒有發(fā)現(xiàn)AMPK和HAS2之間的直接聯(lián)系,。因此，測試了p47phox 是否參與HAS2的介導(dǎo),。用p47phox siRNA轉(zhuǎn)染時(shí),，低剪切應(yīng)力不能顯著降低HAS2的表達(dá)。因此,，低剪切應(yīng)力通過AMPKα/p47phox 通路誘導(dǎo)HAS2表達(dá)的變化,。

總之，小檗堿調(diào)節(jié)低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的透明質(zhì)酸降解不僅抑制了p47phox 和Hyal2活性,，也增強(qiáng)了HAS2的表達(dá),。

圖4   BBR介導(dǎo)透明質(zhì)酸代謝作用的示意圖

BBR可以逆轉(zhuǎn)LSS誘導(dǎo)的透明質(zhì)酸損傷。該過程可能是通過調(diào)節(jié)AMPK活化,，然后減少p47phox的磷酸化和 Hyal2 激活,。此外，BBR還減弱了LSS誘導(dǎo)的HAS2失活,。同樣,，HAS2的表達(dá)也受到AMPK活性的調(diào)節(jié)。因此，合成和分解代謝均受BBR調(diào)節(jié),。

總之,，該研究表明，小檗堿處理可以通過增加AMPKa的磷酸化來減弱低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的透明質(zhì)酸降解,，進(jìn)而下調(diào) p47phox和Hyal2活性,，并上調(diào)HAS2的表達(dá)。

參考文獻(xiàn)：Yang H, Zhu L, Gu Y, Kong X, Yan Liu, Chen M, Xie X, Luo J, Chen S. Berberine inhibits low shear stress-induced glycocalyx degradation via modulating AMPK and p47phox/Hyal2 signal pathway. Eur J Pharmacol. 2019 Aug 5;856:172413. doi: 10.1016/j.ejphar.2019.172413. Epub 2019 May 29. PMID: 31152700.

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