急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是一種肺部炎癥性損傷,，其特點(diǎn)是急性呼吸衰竭,，可導(dǎo)致肺順應(yīng)性和 CO2突然下降,，肺容積減少,，導(dǎo)致低氧血癥和呼吸窘迫。但是,，ARDS的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚,。

間充質(zhì)干細(xì)胞是從骨髓和其他組織中分離出來的非造血干細(xì)胞，具有免疫調(diào)節(jié)和再生特性,，可直接抑制疾病對器官的損害或通過減少細(xì)胞死亡間接抑制有害因子的釋放,，有效避免炎癥發(fā)生，組織損傷和器官衰竭惡化,。有研究指出,，ARDS患者靜脈輸注間充質(zhì)干細(xì)胞可通過釋放多種生物活性因子，與受損組織相互作用,，減輕肺損傷,，改善患者的長期肺功能,。

另一方面,，研究表明，MSCs的局部應(yīng)用可通過CXCL12/CXCR4信號軸促進(jìn)內(nèi)源性細(xì)胞增殖,、血管生成和裂解,，參與創(chuàng)面修復(fù)過程。CXCL12 是一種關(guān)鍵趨化因子，參與多種穩(wěn)態(tài)過程,，如神經(jīng)調(diào)節(jié),、胚胎發(fā)生、血管和淋巴細(xì)胞形成,，其表達(dá)在組織愈合和傷口愈合過程中上調(diào),。此外，CXCL12 是 CXCR4 的趨化因子配體,，CXCR4 常在造血干細(xì)胞,、淋巴細(xì)胞和骨髓內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)。CXCL12 與 CXCR4 結(jié)合后,，調(diào)節(jié)多種信號通路,，包括基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖,、存活和凋亡,，并參與免疫缺陷、炎癥性疾病和癌癥的發(fā)展,。

ARDS 患者常表現(xiàn)出廣泛的肺泡上皮損傷和炎癥性水腫,。最新研究表明，細(xì)胞凋亡和裂解是 ARDS 肺泡損傷的關(guān)鍵特征,，可能與肺泡血管內(nèi)皮損傷有關(guān),。

湖南省湘潭市中心醫(yī)院外科重癥監(jiān)護(hù)室課題組的一項研究以 TNF-α 刺激肺細(xì)胞凋亡構(gòu)建 A549/MSCs 體外共培養(yǎng)模型，并通過尾靜脈注射 MSCs 構(gòu)建 LPS 誘導(dǎo)的 ARDS 小鼠模型,。通過敲低CXCL12和CXCR4的表達(dá),，探討MSCs對ARDS細(xì)胞凋亡的影響。研究發(fā)現(xiàn)MSCs抑制ARDS引起的肺泡上皮細(xì)胞凋亡,，揭示了MSCs在肺泡上皮細(xì)胞中的作用是通過CXCL12/CXCR4軸調(diào)控的機(jī)制,。

TNF-α誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡和裂解并抑制細(xì)胞增殖

A549細(xì)胞（肺癌人類肺泡基底上皮細(xì)胞）用25 ng/ml TNF-α（腫瘤壞死因子-α）處理，體外建立急性肺損傷模型,。CCK-8和Celltiter-Lumi檢測顯示,，細(xì)胞增殖和活力呈時間依賴性下降（圖1 a-b）。與對照組相比,，TNF-α組ROS,、MDA水平升高，SOD,、GSH-px水平降低（圖1 c-d）,，Caspase 1、Caspase 3,、Caspase 8,、Caspase 9的活性顯著增強(qiáng)（圖1 e）,。蛋白質(zhì)印跡檢測顯示，TNF-α組Caspase 1,、Cleaved Caspase 3,、Caspase 8、Caspase 9,、Caspase 11,、Bax、GSDMD表達(dá)上調(diào),，而Bcl-2,、p-ERK1/ 2、WNT,、β-catenin,、Cyclin D1表達(dá)下調(diào)（圖1 f）。這些結(jié)果表明,，TNF-α增強(qiáng)了A549細(xì)胞的凋亡,、裂解和氧化，但降低了抗氧化水平和細(xì)胞增殖,。

圖1   TNF-α誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡,。

（a）CCK-8 檢測細(xì)胞增殖；（b）Celltiter-Lumi 檢測細(xì)胞活力,；（c）細(xì)胞氧化水平檢測,；（d）細(xì)胞氧化應(yīng)激水平檢測；（e）Caspase 活性檢測,；（f）蛋白質(zhì)表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡檢測,。

MSCs通過CXCL12/CXCR4軸抑制TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和裂解，促進(jìn)細(xì)胞增殖

CCK-8 和 Celltiter-Lumi 檢測到 MSCs 處理逆轉(zhuǎn)了細(xì)胞增殖和活力的下降（圖2 a-b）,。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示,，MSCs組中Caspase 9、Caspase 11,、Bax和GSDMD表達(dá)下調(diào),，Bcl-2、p-ERK1/2,、WNT,、β-catenin和Cyclin D1表達(dá)上調(diào)（圖2 c）。與 MSCs 共培養(yǎng)后,，TNF-α 處理的 A549 細(xì)胞中 ROS 和 MDA 水平升高,，SOD 和 GSH-px 水平降低（圖2 d-e），Caspase 1,、Caspase 3,、Caspase 8、Caspase 9的活性受到抑制（圖2 f）,。ELISA顯示,，TNF-α處理后A549細(xì)胞中CXCL12的表達(dá)上調(diào)（圖2 g）。

圖2   MSCs 抑制 TNF-α 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,。

（a）CCK-8 檢測細(xì)胞增殖,；（b）Celltiter-Lumi 檢測細(xì)胞活力；（c）蛋白質(zhì)表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡檢測,；（d）細(xì)胞氧化水平檢測,；（e）細(xì)胞氧化應(yīng)激水平檢測；（f）Caspase 活性檢測,；（g）A549 細(xì)胞培養(yǎng)基中 CXCL12 的 ELISA 檢測,。

MSCs 通過 CXCL12/CXCR4 軸減少 ARDS 肺組織的病理損傷

在熒光顯微鏡下，實(shí)驗發(fā)現(xiàn),，shCXCL12 + shCXCR4組肺組織中MSCs的數(shù)量明顯少于shCXCL12 + MSCs組和shCXCR4+ MSCs組（圖3 a）,。此外，shCXCL12 + shCXCR4組小鼠肺組織表現(xiàn)出廣泛的間質(zhì)水腫,、出血和炎性細(xì)胞浸潤,，肺泡間隔纖維組織增生，肺泡壁增厚,，肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損,。MSCs明顯減輕了肺組織的病理損傷，減少了膠原纖維,。

小鼠肺損傷評分和肺纖維化評分顯著降低,，敲低CXCR4或CXCL12可逆轉(zhuǎn)MSCs對ARDS小鼠的治療作用（圖3 b-d）。shCXCL12 + shCXCR4組血清ROS,、MDA水平升高,，SOD、GSH-px水平降低（圖3 e-f）,。Caspase 1,、Caspase 3、Caspase 8 和 Caspase 9 活性的抑制被逆轉(zhuǎn)（圖3 g）,。與MSCs組,、shCXCR4或shCXCL12組相比，shCXCL12 + shCXCR4 組血清IL-1β,、TNF-α水平升高,，IL-10水平降低（圖3 h）。在shCXCL12 + shCXCR4 組小鼠組織中,，Caspase 1,、Cleaved Caspase 3,、Caspase 8、Caspase 9,、Caspase 11,、Bax、GSDMD的表達(dá)上調(diào),，Bcl-2,、p-ERK1/2、WNT,、β-catenin,、x Cyclin D1 的表達(dá)下調(diào)（圖3 i）。在敲除CXCR4或（和）CXCL12的表達(dá)后,，MSCs對ARDS小鼠的肺組織失去了修復(fù)作用,。

圖3   MSCs 減少了 ARDS 肺組織的病理損傷。

（a）熒光觀察小鼠肺組織中 MSCs 的分布,；（b）HE染色觀察小鼠肺組織的病理變化和纖維化情況,；（c）Masson染色觀察小鼠肺組織的病理變化和纖維化；（d）小鼠肺損傷評分和肺纖維化評分,；（e）組織氧化水平檢測,；（f）組織氧化應(yīng)激水平檢測；（g）Caspase 活性檢測,；（h）ELISA 檢測小鼠血清炎癥相關(guān)因子,；（i）蛋白質(zhì)表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡檢測。

圖4 圖形概要

總之,，該結(jié)果表明 TNF-α 增強(qiáng)了 A549 細(xì)胞的凋亡,、裂解和氧化，但降低了抗氧化水平和細(xì)胞增殖,。此外,，MSCs可通過CXCL12/CXCR4信號軸抑制TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和裂解，促進(jìn)細(xì)胞增殖,，減輕ARDS肺組織的病理損傷,。綜上所述，MSCs可通過CXCL12/CXCR4信號軸抑制TNF-α和LPS誘導(dǎo)的肺細(xì)胞凋亡,，從而改善ARDS小鼠肺組織損傷和肺纖維化,。這些發(fā)現(xiàn)為 ARDS 中 MSCs 的干預(yù)目標(biāo)提供了新的見解。

參考文獻(xiàn)：He X, Li C, Yin H, Tan X, Yi J, Tian S, Wang Y, Liu J. Mesenchymal stem cells inhibited the apoptosis of alveolar epithelial cells caused by ARDS through CXCL12/CXCR4 axis. Bioengineered. 2022 Apr;13(4):9060-9070. doi: 10.1080/21655979.2022.2052652. PMID: 35301927; PMCID: PMC9161978.

小編旨在分享,、學(xué)習(xí),、交流生物科學(xué)等領(lǐng)域的研究進(jìn)展。如有侵權(quán)或引文不當(dāng)請聯(lián)系小編修正。

微信搜索公眾號“Naturethink",，了解更多細(xì)胞體外仿生培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用,！