成纖維細胞是間充質(zhì)基質(zhì)中常見的貼壁細胞類型。成纖維細胞和間充質(zhì)干細胞具有相似的 MSC 標記,，可以分化成成骨、脂肪和軟骨細胞譜系,。成纖維細胞和間充質(zhì)干細胞的相似性支持使用成纖維細胞作為研究成骨的合適細胞類型,。當干細胞處于由生物材料、生長因子和組織組成的微環(huán)境中時,，適當?shù)臋C械刺激可以促進干細胞的成骨分化,。臨床和基礎(chǔ)研究表明，外部機械刺激,，例如因拉伸而增加的張力,，可以影響干細胞的成骨分化。機械轉(zhuǎn)導(dǎo)通常通過整合素將機械刺激轉(zhuǎn)化為生化信號,，然后影響下游細胞活動的過程,。

整合素是存在于細胞表面的跨膜受體,，是由非共價鍵連接的α和β亞基組成的功能性異二聚體。整合素的聚集和激活募集和激活細胞內(nèi)信號蛋白,，如粘著斑激酶（FAK）,、紐蛋白和踝蛋白，它們有助于粘著斑并影響干細胞的分化,。

Yes 相關(guān)蛋白（YAP）是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子,，通過與可控制轉(zhuǎn)錄的 TEAD（TEA 結(jié)構(gòu)域 DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子家族）DNA 結(jié)合蛋白結(jié)合，促進細胞增殖并調(diào)節(jié)干細胞分化,。研究表明,，通過敲除肌動蛋白細胞骨架的調(diào)節(jié)因子或用 F-肌動蛋白抑制藥物處理來控制 F-肌動蛋白水平會顯著影響 YAP 活性。然而,，機械刺激如何通過整合素-微絲軸影響 YAP 以調(diào)節(jié)干細胞成骨分化仍不清楚,。

廣東省醫(yī)學(xué)生物力學(xué)重點實驗室、廣州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科的課題組曾研究了整合素αVβ3與循環(huán)拉伸應(yīng)力（CTS）誘導(dǎo)的早期成骨分化之間的關(guān)系,。整合素αVβ3的激活導(dǎo)致肌動蛋白絲重排并調(diào)節(jié)核YAP的表達,。此外還發(fā)現(xiàn)FAK參與了粘著斑的形成，整合素αVβ3介導(dǎo)的FAK磷酸化在CTS誘導(dǎo)的成骨分化早期發(fā)揮了作用,。該研究表明整合素αVβ3可作為骨修復(fù)的治療靶點,。

循環(huán)拉伸應(yīng)力促進成纖維細胞中的細胞增殖和成骨

研究探討了循環(huán)拉伸應(yīng)力（0.5 Hz，10%）,、細胞增殖和成纖維細胞成骨分化之間的關(guān)系,。首先，成纖維細胞暴露于循環(huán)拉伸應(yīng)力 4 天和 7 天,。如圖1 a,，成纖維細胞增殖響應(yīng)于循環(huán)拉伸應(yīng)力而增加。作為成骨分化標志物的 ALP 和 RUNX2 的蛋白質(zhì)和 RNA 表達在循環(huán)拉伸應(yīng)力下 7 天后增加（圖1 c,、d）,。成纖維細胞的 ALP 染色也獲得了類似的結(jié)果，在循環(huán)拉伸應(yīng)力下ALP 染色更高（圖1 b）,。這些結(jié)果表明,，循環(huán)拉伸應(yīng)力促進了成纖維細胞的細胞增殖和早期成骨分化。

圖1   CTS下成纖維細胞中細胞增殖,、早期成骨分化和整合素αVβ3的表達,。

（a）細胞增殖在 CTS 下 1 天、4 天,、7 天,。（b ）ALP 染色在CTS 下 4 天和 7 天。（c）ALP和RUNX2蛋白表達在CTS下4天和7天,。（d ）ALP和RUNX2 mRNA表達在CTS下4天和7天,。（e）整合素αVβ3 mRNA表達在CTS下4天和7天,。（f）整合素 αVβ3 的免疫熒光在 CTS 下 7 天。

循環(huán)拉伸應(yīng)力誘導(dǎo)的早期成骨分化依賴于整合素αVβ3的表達和激活

為了探索整合素是否參與循環(huán)拉伸應(yīng)力誘導(dǎo)的成骨分化和細胞增殖,，通過qRT-PCR和免疫熒光分析了整合素αVβ3在成纖維細胞中的表達,。實驗發(fā)現(xiàn)整合素αVβ3的表達在循環(huán)拉伸應(yīng)力下增加（圖1 e、f）,，表明循環(huán)拉伸應(yīng)力促進整合素αVβ3的表達,。因此，研究了循環(huán)拉伸應(yīng)力下整合素αVβ3與成骨分化之間的關(guān)聯(lián),。為了確定循環(huán)拉伸應(yīng)力是否以整合素αVβ3依賴性方式刺激成骨分化,，整合素αVβ3的功能被整合素αVβ3的拮抗劑shRNA或RGDyk抑制。如圖2 a,，當成纖維細胞中整合素αV或β3的表達下調(diào)時,，循環(huán)拉伸應(yīng)力下細胞增殖減少。

然后,，通過 ALP 染色,、蛋白質(zhì)印跡和 qRT-PCR 檢測整合素 αVβ3 對成骨分化的影響。shRNA-整合素αV和β3組的ALP染色比CTS組少（圖2 b）,。蛋白質(zhì)印跡顯示,，在成纖維細胞中整合素αVβ3表達下調(diào)后，ALP和RUNX2的蛋白質(zhì)表達降低（圖2 c,、e）,。通過 qRT-PCR 獲得了類似的結(jié)果，當整合素 αVβ3 表達被抑制時,，ALP 和 RUNX2 mRNA 的表達降低（圖2 d,、f）。這些結(jié)果表明,，循環(huán)拉伸應(yīng)力通過整合素αVβ3促進成纖維細胞的早期成骨分化和細胞增殖,。

圖2   CTS 通過整合素 αVβ3 調(diào)節(jié)細胞增殖和早期成纖維細胞成骨分化。

（a）GM,、NC、shRNA-整合素αV和shRNA-整合素β3組在CTS下的細胞增殖,。（b）GM,、NC、shRNA-整合素αV和shRNA-整合素β3組在CTS下的ALP染色,。（c）在 GM 和 RGDyk 組中 CTS 下 ALP 和 RUNX2 的蛋白質(zhì)表達,。（d）GM 和 RGDyk 組在 CTS 下 ALP 和 RUNX2 的 mRNA 表達。（e）在 CTS 下GM,、NC,、shRNA-整合素 αV 和 shRNA-整合素 β3 組中 ALP 和 RUNX2 的蛋白質(zhì)表達,。（f） CTS 下 GM、NC,、shRNA-整合素 αV 和 shRNA-整合素 β3 組中 ALP 和 RUNX2 的 mRNA 表達

成骨過程中通過整合素αVβ3調(diào)節(jié)循環(huán)拉伸應(yīng)力的肌動蛋白絲

為了更好地了解循環(huán)拉伸應(yīng)力下整合素αVβ3與肌動蛋白絲之間的關(guān)聯(lián),，實驗檢測了整合素αVβ3被抑制時β-肌動蛋白的表達。蛋白質(zhì)印跡和qRT-PCR顯示β-肌動蛋白的表達在循環(huán)拉伸應(yīng)力下增加,。當整合素 αVβ3 的表達受到抑制時,，RGDyk 組中 β-肌動蛋白的表達低于 CTS 組。還發(fā)現(xiàn) shRNA-整合素 αV 或 β3 組中 β-肌動蛋白的表達低于 CTS 組,。免疫熒光顯示,，微絲應(yīng)力纖維在循環(huán)拉應(yīng)力作用下呈網(wǎng)狀分散在靠近細胞膜的結(jié)構(gòu)中。當整合素αVβ3的表達受到抑制時,，微絲應(yīng)力纖維以與GM（培養(yǎng)基）組相似的拉長方式排列,。這些結(jié)果表明，循環(huán)拉伸應(yīng)力上調(diào)β-肌動蛋白的表達并通過整合素αVβ3改變肌動蛋白絲的結(jié)構(gòu),。

為了研究肌動蛋白絲是否參與由循環(huán)拉伸應(yīng)力誘導(dǎo)的成骨分化,，使用細胞松弛素D 來抑制肌動蛋白絲的聚合。蛋白質(zhì)印跡顯示,，在循環(huán)拉伸應(yīng)力下,，細胞松弛素D降低了ALP和RUNX2的表達。這些結(jié)果表明,，循環(huán)拉伸應(yīng)力通過整合素αVβ3-微絲軸調(diào)節(jié)成纖維細胞成骨分化的早期階段,。

成骨過程中通過整合素αVβ3-微絲軸調(diào)節(jié)循環(huán)拉伸應(yīng)力核YAP

實驗還探討了循環(huán)拉伸應(yīng)力是否通過整合素αVβ3-微絲軸調(diào)節(jié)核 YAP 的表達。蛋白質(zhì)印跡和qRT-PCR顯示核YAP的表達在循環(huán)拉伸應(yīng)力下增加,。當整合素αVβ3的表達受到抑制時,，蛋白質(zhì)印跡顯示核YAP的表達低于CTS組。免疫熒光結(jié)果顯示,，在循環(huán)拉應(yīng)力作用下,，核YAP的表達明顯增加。此外還發(fā)現(xiàn),，當整合素 αVβ3 被抑制時,，核 YAP 的表達降低。這些結(jié)果表明,，循環(huán)拉伸應(yīng)力通過整合素αVβ3上調(diào)核YAP,。

當細胞松弛素D 抑制 β-肌動蛋白的聚合時，蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光顯示核 YAP 的表達在循環(huán)拉伸應(yīng)力下降低,。蛋白質(zhì)印跡還顯示,，在維替泊芬存在下，在循環(huán)拉伸應(yīng)力下ALP和RUNX2的表達降低。上述實驗表明,，在成骨分化早期,，循環(huán)拉伸應(yīng)力通過整合素αVβ3-微絲軸調(diào)節(jié)核YAP。

循環(huán)拉伸應(yīng)力促進成骨過程中粘著斑的形成和 FAK 磷酸化

由肌動蛋白絲和整合素形成的粘著斑需要踝蛋白（talin）,、FAK 和紐蛋白（vinculin）才能將 CTS 傳遞到基底,。實驗檢測了 talin-1、FAK 和 vinculin 的表達,，以探索它們與整合素 αVβ3 的關(guān)聯(lián),。蛋白質(zhì)印跡和qRT-PCR顯示在循環(huán)拉伸應(yīng)力下talin-1、FAK和vinculin的表達增加（圖3 a,、b）,。蛋白質(zhì)印跡顯示，當整合素αVβ3的表達被c（RGDyk）或shRNA抑制時,，talin-1,，FAK和vinculin的表達降低（圖3 c、e）,。qRT-PCR 獲得了類似的結(jié)果（圖3 d,、f）。免疫熒光顯示,，紐蛋白在循環(huán)拉伸應(yīng)力下的可見粘著斑斑塊中表達和定位更高,。整合素αVβ3的抑制與紐蛋白表達的顯著降低相關(guān)（圖3 g）。這些結(jié)果表明,，循環(huán)拉伸應(yīng)力通過整合素αVβ3促進粘著斑的形成,。

接下來，研究了 FAK 磷酸化在循環(huán)拉伸應(yīng)力下在成骨分化中的作用,。蛋白質(zhì)印跡顯示FAK的磷酸化響應(yīng)于循環(huán)拉伸應(yīng)力而增加,，并且整合素αVβ3的抑制下調(diào)了FAK的磷酸化（圖3 h、i）,。實驗發(fā)現(xiàn),，當 FAK 的磷酸化被 Y-15（一種小分子抑制劑）抑制時，ALP 和 RUNX2 的表達降低（圖3 j）,。這些結(jié)果表明,，FAK不僅參與了含有整合素αVβ3的粘著斑的形成，而且FAK的磷酸化有助于循環(huán)拉伸應(yīng)力誘導(dǎo)的成骨分化的早期階段,。

圖3   CTS 誘導(dǎo)的整合素 αVβ3 激活調(diào)節(jié)粘著斑相關(guān)蛋白和 FAK 的磷酸化,，以促進成骨分化的早期階段。

（a）talin-1,、FAK 和 vinculin 的蛋白質(zhì)表達在 CTS 下 4 天和 7 天。（b）talin-1、FAK和vinculin mRNA表達在CTS下4天和7天,。（c）GM 和 RGDyk 組中 CTS 下 talin-1,、FAK 和 vinculin 的蛋白質(zhì)表達。（d）GM 和 RGDyk 組在 CTS 下 talin-1,、FAK 和 vinculin 的 mRNA 表達,。（e）在 CTS 下 GM、NC,、shRNA-整合素αV 和 shRNA-整合素 β3 組中 talin-1,、FAK 和 vinculin 的蛋白質(zhì)表達。（f）GM,、NC,、shRNA-整合素αV和shRNA-整合素β3組在CTS下talin-1、FAK和vinculin的mRNA表達,。（g） GM,、CTS、NC,、shRNA-integrin αV 和 shRNA-integrin β3 組在 CTS 下的 vinculin 免疫熒光 7 天,。（h） CTS 下 FAK 磷酸化水平 7 天。（i）CTS 下 GM,、NC,、shRNA-整合素 αV 和 shRNA-整合素 β3 組中 FAK 的磷酸化水平。（j）CTS下CTS組和Y15組ALP和RUNX2蛋白表達,。

循環(huán)拉伸應(yīng)力通過整合素αVβ3的激活對成纖維細胞早期成骨分化產(chǎn)生積極影響,，導(dǎo)致微絲細胞骨架的重排。此外,，循環(huán)拉伸應(yīng)力刺激的肌動蛋白絲的重排和 FAK 的磷酸化通過整合素 αVβ3 導(dǎo)致人成纖維細胞中核 YAP 的表達增加,。在未來的研究中，整合素αVβ3應(yīng)該被認為是體內(nèi)實驗的一個有希望的靶點,，以驗證其促進骨修復(fù)的功能,。

參考文獻：Peng Y, Qu R, Feng Y, Huang X, Yang Y, Fan T, Sun B, Khan AU, Wu S, Dai J, Ouyang J. Regulation of the integrin αVβ3- actin filaments axis in early osteogenesis of human fibroblasts under cyclic tensile stress. Stem Cell Res Ther. 2021 Oct 7;12(1):523. doi: 10.1186/s13287-021-02597-y. PMID: 34620239; PMCID: PMC8496073.

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