骨關節(jié)炎（OA）是一種以關節(jié)軟骨變性,、軟骨下骨硬化和骨贅形成為特征的慢性退行性關節(jié)疾病。由于軟骨細胞是關節(jié)軟骨中的細胞,，軟骨細胞存活率的下降會導致關節(jié)軟骨的退變,。除了遺傳和環(huán)境因素外,，機械應力在骨關節(jié)炎的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用,。先前的研究報道,，機械應力上調(diào)了一種新型機械敏感離子通道 Piezo1 在軟骨細胞中的表達，進而增加了軟骨細胞的凋亡,，最終導致軟骨退化,。因此，探究參與調(diào)節(jié)機械應力誘導的Piezo1激活過程的分子就尤為關鍵,。

機械應力的信號轉(zhuǎn)導途徑已被廣泛研究,。在機械應力下，細胞膜會發(fā)生結(jié)構變化,，引起細胞內(nèi)相關分子的活化及對應信號轉(zhuǎn)導通路的激活。作為對機械應力的反應,，Yes 相關蛋白（YAP,，一種轉(zhuǎn)錄共刺激因子）的亞細胞定位從細胞核轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)。細胞質(zhì) YAP 下調(diào) Rho GTPase 酶激活蛋白29（ARHGAP29）的表達,，該蛋白被稱為 RhoA/LIMK/cofilin 通路的調(diào)節(jié)因子,。Cofilin 是一種肌動蛋白結(jié)合蛋白。Cofilin 調(diào)節(jié)的聚合肌動蛋白增強了 Piezo1 的激活,，最終增加了軟骨細胞的凋亡,。然而,，機械應力介導的信號通路的調(diào)節(jié)，特別是上游分子的調(diào)節(jié),，尚未闡明,。

雌激素受體包括細胞質(zhì)或細胞核中的常規(guī)雌激素受體（ERs）和新型G蛋白偶聯(lián)雌激素受體（GPERs），它們通過快速非基因組通路和慢速基因組通路發(fā)揮調(diào)節(jié)功能,。雌激素受體調(diào)節(jié)細胞增殖,、凋亡和代謝，暗示雌激素受體在維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)中的重要作用,。先前的研究表明,，在雌激素處理后，機械應力誘導的軟骨細胞凋亡顯著降低,。然而,，目前，可能與 OA 發(fā)展有關的機械應力相關的雌激素受體類型仍不清楚,。

青島大學附屬醫(yī)院關節(jié)外科及藥劑科,、濰坊市中醫(yī)院關節(jié)骨科聯(lián)合團隊的一項研究探討了軟骨細胞中機械應力相關的雌激素受體，并試圖辨別與機械應力介導的信號通路密切相關的雌激素受體類型,，并探討它們在 OA 過程中對軟骨細胞凋亡的潛在影響,。

在 Piezo1 沉默后，GPER 在暴露于機械應力的軟骨細胞中上調(diào)

為了探索與 Piezo1 相互作用的分子和調(diào)控網(wǎng)絡,，實驗檢測了轉(zhuǎn)染Piezo1-siRNA后加載機械應力的軟骨細胞轉(zhuǎn)錄譜的變化,。在體外多通道細胞牽張應力加載系統(tǒng)中，加載24 h的周期性牽張應力,，膜性六孔板每孔底部硅膠膜的形變幅度為20％,，周期為10次/min。當顯著的基因表達差異被分組并可視化為熱圖時,，沉默 Piezo1 會導致雌激素相關的轉(zhuǎn)錄特征（圖1 a）,。進一步研究表明，新型雌激素受體 GPER 在 Piezo1 沉默后顯著上調(diào),，而常規(guī) ERα 和 ERβ 沒有顯著變化,。疾病和功能分析表明，差異基因主要參與細胞死亡和存活,，表明 Piezo1 參與機械應力對軟骨細胞存活的調(diào)控過程（圖1 b）,。mRNA表達測量確定GPER隨著Piezo1-siRNA的轉(zhuǎn)染而增加（圖1 c）。Weste blot 結(jié)果與 mRNA 表達一致（圖1 d）,。

圖1    在 Piezo1 沉默后,，GPER 在暴露于機械應力的軟骨細胞中上調(diào)。

（a）在暴露于機械應力的軟骨細胞中 Piezo1 沉默后差異基因表達值的熱圖,。（b）在暴露于機械應力的軟骨細胞中,，Piezo1 沉默后差異基因表達值的疾病和功能分析,。（c）RT-qPCR 分析 Piezo1 沉默軟骨細胞與非沉默軟骨細胞中的 GPER 基因。（d）與非沉默軟骨細胞相比,，Piezo1 沉默的軟骨細胞中 GPER 的蛋白質(zhì)表達,。

GPER 表達在人骨關節(jié)炎軟骨中降低

為了探究GPER對OA的影響，實驗檢測了OA關節(jié)軟骨組織和對照關節(jié)組織中GPER的mRNA表達,。與對照組相比,，定量 mRNA 表達顯示，骨關節(jié)炎關節(jié)軟骨中的 GPER 顯著降低（圖2 a）,。為了進一步證實 GPER 與骨關節(jié)炎軟骨退變之間的關系,，通過蛋白質(zhì)印跡法測量了蛋白質(zhì)水平（圖2 b），并得到一致的結(jié)果,。此外還在人軟骨組織中研究了 GPER 表達,。免疫組織化學染色和 GPER 的相應定量顯示，與對照軟骨相比,，GPER 在退行性軟骨中顯著下調(diào)（圖2 c）,。

圖2    GPER 表達在人骨關節(jié)炎軟骨中降低。

（a）與對照軟骨相比,，退行性軟骨中 GPER 基因的RT-qPCR 分析,。（b）與對照軟骨相比，退行性軟骨中 GPER 的蛋白質(zhì)表達,。（c）在沒有（對照）和有抗 GPER 抗體（的情況下對退行性軟骨和對照軟骨進行免疫組織化學染色,。

GPER的激活減少了機械應力誘導的軟骨細胞凋亡

細胞活力和凋亡相關蛋白（Bcl-2 和 Bax）的表達用于評估軟骨細胞的凋亡。暴露于 24 h 機械應力的軟骨細胞凋亡增加,，其特征是細胞活力顯著下降,、BAX 表達增加和 Bcl-2 表達減少。當暴露于 24 h 機械應力的軟骨細胞用 8 μM 雌激素處理時,，發(fā)現(xiàn)細胞凋亡減少,。然而，單獨的雌激素處理并未對軟骨細胞存活率產(chǎn)生影響,。G15 是 GPER 的抑制劑,，減弱了雌激素對機械應力誘導的軟骨細胞凋亡的抑制作用。這些結(jié)果表明,，GPER 而非 ER 介導了雌激素的抗凋亡作用,。為了進一步證明GPER對減輕機械應力誘導的細胞凋亡的作用，使用siRNA敲除了GPER,。結(jié)果表明,，GPER-siRNA有效阻斷了雌激素的抗細胞凋亡作用,，這與抑制劑應用的結(jié)果一致,。

此外還探討了GPER的特異性激動劑G-1 在機械應力誘導的軟骨細胞凋亡中的潛在作用,。單獨使用 G-1 處理不會導致細胞凋亡顯著增加。與機械應力組相比,，G-1-機械應力組的存活率增加,。然后確認了 G-1 是否通過 GPER 激活來改善軟骨細胞凋亡，發(fā)現(xiàn)G-1的抗軟骨細胞凋亡作用可被有效阻斷,。這些結(jié)果說明G-1模擬雌激素的作用降低機械應力介導的OA軟骨細胞凋亡,。

GPER 抑制機械應力介導的肌動蛋白聚合和 Piezo1 激活

為了揭示 GPER 在機械應力誘導的肌動蛋白聚合和 Piezo1 激活中的作用，用 G-1 或機械應力處理軟骨細胞,。與對照組相比,，機械應力上調(diào)了軟骨細胞中 Piezo1 的熒光強度。然而,，G-1 處理可以顯著減弱該過程中增加的熒光強度（圖3 a）,。Piezo1 的激活與肌動蛋白聚合密切相關。為了闡明肌動蛋白的作用,，用肌動蛋白抑制劑 CytoD 處理軟骨細胞,。與機械應力組相比，CytoD 處理的軟骨細胞中 Piezo1 的表達降低（圖3 a）,，細胞活力和Bcl-2的表達增加,，而BAX的表達減少（圖3 b、c）,。與機械應力處理的細胞相比,，G-1-機械應力處理的軟骨細胞具有顯著降低的肌動蛋白熒光強度（圖3 a），表明 GPER 通過肌動蛋白解聚抑制機械應力介導的 Piezo1 激活,。

圖3    GPER 抑制機械應力介導的肌動蛋白聚合和 Piezo1 激活,。

（a）免疫熒光染色 F-肌動蛋白和 Piezo1。（b）用機械應力,、10 μM G-1 和 8 μM cytoD 處理的軟骨細胞的細胞活力,。（c）對于用機械應力、10 μM G-1 和 8 μM cytoD 處理的軟骨細胞,，Bax 和 Bcl-2 的蛋白質(zhì)表達,。

GPER 通過 YAP-ARHGAP29-RhoA-LIMK-Cofilin 信號通路調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合

為了確認 YAP 是否參與機械應力誘導的細胞凋亡，使用 siRNA 敲除來抑制 YAP,。結(jié)果表明,，YAP-siRNA 有效阻斷了 G-1 的抗凋亡作用。這些結(jié)果表明,，YAP 在由 G-1 和機械應力調(diào)節(jié)的細胞凋亡中發(fā)揮作用,。此外，探討了 YAP 是否對肌動蛋白聚合和相關信號通路具有潛在的調(diào)節(jié)作用。免疫熒光結(jié)果表明,，YAP 沉默有效地減弱了 G-1 誘導的 GPER 激活所導致的肌動蛋白解聚和 Piezo1 的失活,。作為肌動蛋白聚合相關信號通路的重要調(diào)節(jié)分子，ARHGAP29通過促進與GTP結(jié)合的（活性的）RhoA向其GDP結(jié)合（非活性）形式的轉(zhuǎn)化而降低RhoA的活性,，進而抑制與肌動蛋白聚合密切相關的LIMK/Cofilin途徑,。研究數(shù)據(jù)顯示，與對照組相比,，機械應力組ARHGAP29蛋白的表達明顯降低,，RhoA活性、LIMK活性和cofilin磷酸化水平升高,，可以通過G-1處理來挽救,。總之,，GPER可通過YAP-ARHGAP29-RhoA-LIMK-Cofilin信號抑制機械應力所致的肌動蛋白聚合和Piezo1的激活,。

G-1激活的GPER在體內(nèi)抑制關節(jié)軟骨退化

通過構建骨關節(jié)炎大鼠模型評估關節(jié)軟骨退行性變程度（圖4 a），OARSI 評分數(shù)據(jù)顯示,，OA + NC 組的關節(jié)軟骨退化比 Sham + NC 組更嚴重,，而 G-1 處理減弱了這一病理過程。此外使用了 GPER 和 YAP 的免疫組織化學染色,。如圖4 b,，G-1處理可以增強大鼠關節(jié)軟骨中YAP的表達。這些數(shù)據(jù)表明,，關節(jié)內(nèi)注射 G-1 在體內(nèi)具有潛在的保護作用,。

圖4    G-1 激活的 GPER 在體內(nèi)抑制關節(jié)軟骨退化。

（a）番紅固綠染色各組關節(jié)軟骨及OARSI評分,。（b）免疫熒光染色 GPER 和 YAP,。

總而言之，該研究通過揭示 GPER 是機械應力介導的 Piezo1 激活的關鍵調(diào)節(jié)劑,，并通過 YAP/ARHGAP29/RhoA/LIMK/cofilin 途徑機械觸發(fā) OA 進展過程中的軟骨細胞凋亡,，從而提出了一種新的調(diào)節(jié)和控制機制，并闡明 GPER 作為 OA 治療靶點的潛在應用價值,。

參考文獻：Sun Y, Leng P, Guo P, Gao H, Liu Y, Li C, Li Z, Zhang H. G protein coupled estrogen receptor attenuates mechanical stress-mediated apoptosis of chondrocyte in osteoarthritis via suppression of Piezo1. Mol Med. 2021 Aug 28;27(1):96. doi: 10.1186/s10020-021-00360-w. PMID: 34454425; PMCID: PMC8403401.

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