炎癥是機(jī)體受到外界微生物入侵后的一種保護(hù)性反應(yīng),。作為影響最大的炎癥誘導(dǎo)劑,，內(nèi)毒素脂多糖（LPS）為革蘭氏陰性菌外膜中的脂多糖成分,。巨噬細(xì)胞通過產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子被 LPS 激活,，其他炎癥介質(zhì)包括活性氧（ROS）、前列腺素E2（PGE2）和誘導(dǎo)型環(huán)氧合酶-2（COX-2）,。此外,，參與控制炎癥的另一個途徑是核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2（Nrf2）。大量研究表明,，Nrf2 有助于預(yù)防多種疾病,，包括癌癥、心血管疾病,、神經(jīng)退行性疾病和炎癥,。腸道不僅是人體重要的消化吸收器官，也是最大的免疫器官,。腸上皮細(xì)胞和各種免疫細(xì)胞分布在腸黏膜內(nèi),，包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞,，在腸黏膜免疫中發(fā)揮重要作用,。巨噬細(xì)胞作為先天免疫的效應(yīng)細(xì)胞，在腸道固有層中吞噬和清除細(xì)菌并分泌細(xì)胞因子,，從而維持腸道環(huán)境的穩(wěn)定,。Caco-2 細(xì)胞模型不僅可用于研究腸道吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，還可用于體外研究腸黏膜上皮細(xì)胞的分泌和屏障功能,。細(xì)胞共培養(yǎng)模型可以模擬體內(nèi)微環(huán)境,，在一定程度上彌補(bǔ)了單層細(xì)胞培養(yǎng)對生理環(huán)境模擬的不足。上皮細(xì)胞與免疫細(xì)胞的共培養(yǎng)是體外研究腸上皮細(xì)胞與黏膜內(nèi)免疫細(xì)胞相互作用機(jī)制的有力方法,。因此,，南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室課題組的一項研究通過 LPS 處理建立 RAW264.7 巨噬細(xì)胞和腸上皮樣 Caco-2 細(xì)胞的共培養(yǎng)模型，以模擬炎癥性腸道環(huán)境,。靈芝是一種藥食兩用的菌類,。研究人員實(shí)驗(yàn)室分離出一種主要的多糖成分，命名為靈芝多糖（PSG-1）,，純度>99.8%,。已發(fā)現(xiàn) PSG-1 具有多種生物活性，例如抗腫瘤活性,、化學(xué)保護(hù)作用和免疫調(diào)節(jié)作用,。該研究旨在探討 PSG-1 對 LPS 誘導(dǎo)的炎癥巨噬細(xì)胞模型和 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)炎癥模型的直接和間接調(diào)控作用，旨在闡明其抗炎作用的潛在機(jī)制,。PSG-1 降低 LPS 誘導(dǎo)的 RAW264.7 巨噬細(xì)胞和腸樣 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)模型中細(xì)胞因子的分泌實(shí)驗(yàn)先測定 LPS 誘導(dǎo)的 RAW264.7 巨噬細(xì)胞和腸樣 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)模型中細(xì)胞因子的產(chǎn)生,，以檢測 PSG-1 的抗炎作用,。首先確定在 LPS 誘導(dǎo)的 RAW264.7 巨噬細(xì)胞和腸樣 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)模型中,，PSG-1 是否可以抑制 LPS 誘導(dǎo)的 TNF-α,、IL-6、IL-1β 的分泌,。與未刺激的細(xì)胞相比,，LPS 顯著增加了 LPS 誘導(dǎo)的 RAW264.7 巨噬細(xì)胞中 TNF-α、IL-6 和 IL-β 的分泌,。然而,，當(dāng) PSG-1 與 LPS 處理的 RAW264.7 巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)時，PSG-1 處理（160 μg/mL）使這三種促炎細(xì)胞因子的分泌分別減少了 60.5%,、32.1%,、46.1%。在模擬腸道炎癥的 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)模型中,，還分析了促炎細(xì)胞因子的分泌,。在 PSG-1 存在下，腸樣 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)模型中,，炎癥刺激后測量 TNF-α,、Il-6、IL-1β 的水平,。PSG-1 降低 LPS 誘導(dǎo)的 RAW264.7 巨噬細(xì)胞和腸樣 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)模型中細(xì)胞內(nèi) ROS 的產(chǎn)生
ROS 的過量產(chǎn)生導(dǎo)致氧化應(yīng)激,，損傷與炎癥相關(guān)的疾病中的細(xì)胞和組織。為了探索 PSG-1 對氧化應(yīng)激的特性,，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi) ROS 的產(chǎn)生,。當(dāng) RAW264.7 巨噬細(xì)胞用 LPS 刺激時，細(xì)胞內(nèi) ROS 的產(chǎn)生增加且上調(diào)顯著,，而 PSG-1+LPS 聯(lián)合處理時這些效應(yīng)呈濃度依賴性減弱（分別為 47.9%, 75.8 %,、94.3%）。類似的趨勢出現(xiàn)在腸樣 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)炎癥模型中,，PSG-1 減少 LPS 刺激的共培養(yǎng)炎癥模型中的 ROS 產(chǎn)生,。
PSG-1 抑制 LPS 誘導(dǎo)的 COX-2 表達(dá)的激活為了研究 PSG-1 的潛在抗炎作用，通過蛋白質(zhì)印跡分析確定了 COX-2 的表達(dá),。對照組很少檢測到 COX-2 的表達(dá),。然而，LPS 處理后表達(dá)顯著上升,，在 LPS 刺激的 RAW264.7 巨噬細(xì)胞（20.3%,、55.9%、56.2%）或腸樣 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)模型（38.1%,、57.7%,、60.5%）中，用 PSG-1 處理 RAW264.7 巨噬細(xì)胞或腸樣 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)模型均以濃度依賴性方式抑制了 LPS 誘導(dǎo)的 COX-2 水平,。PSG-1 抑制 LPS 誘導(dǎo)的 MAPKs 信號通路激活炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生也受 MAPKs 控制,。使用蛋白質(zhì)印跡分析檢測 PSG-1 對 RAW264.7 巨噬細(xì)胞和腸樣 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)模型中 LPS 誘導(dǎo)的 Erk1/2,、JNK 和 p38 MAPK 磷酸化的影響。LPS 刺激顯著增加 RAW264.7 巨噬細(xì)胞中磷酸化的 ERK,、JNK 和 p38 表達(dá),。同時，PSG-1 顯著抑制 LPS 誘導(dǎo)的 Erk1/2,、JNK 和 p38 磷酸化,。PSG-1 在腸樣 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)模型中抑制 LPS 誘導(dǎo)的 Erk1/2、JNK 和 p38 磷酸化,。PSG-1 調(diào)節(jié) Nrf2/keap1 介導(dǎo)的氧化應(yīng)激信號通路Nrf2/kelch 樣 ECH 相關(guān)蛋白1（Keap1）信號通路的蛋白質(zhì)表達(dá)是在 LPS 單獨(dú)刺激或在 RAW264.7 巨噬細(xì)胞和腸樣 Caco-2/RAW264 中存在 PSG-1 的情況下測定的,。在 LPS 誘導(dǎo)的 RAW264.7 巨噬細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與對照組相比,，LPS 刺激降低了 Nrf2 的表達(dá),，而與 LPS 組相比，在 80 或 160 μg/mL 劑量下與 PSG-1 聯(lián)合使用可顯著提高（42.3%,、25.8%）Nrf2 的活性,。同時，如在 LPS 刺激的腸樣 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)模型中觀察到的（圖5 B）,，LPS 刺激誘導(dǎo) Nrf2 表達(dá)的顯著下調(diào),，在 LPS 誘導(dǎo) Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)模型（30.7%, 106%）中，PSG-1 處理（40, 160 μg/mL）后 Nrf2 水平顯著升高,。此外在 LPS 誘導(dǎo)的 RAW264.7 巨噬細(xì)胞中,，暴露于 LPS 后 Keap1 的蛋白水平降低，而 LPS+PSG-1 處理較 LPS 組相比,，Keap1 顯著上調(diào)（33.0%,、78.8%、31.7%）,。腸樣 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)模型僅用 LPS 處理時,，Keap1 的表達(dá)減少。然而,，PSG-1 處理顯著上調(diào) LPS 誘導(dǎo)的 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)模型中 Keap1 的表達(dá)（34.4%,、41.2%、103.0%）,。總之,，該研究證明 PSG-1 降低 LPS 誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6 和 IL-1β）的分泌和 ROS 水平,，并抑制 LPS 誘導(dǎo)的 RAW264.7 巨噬細(xì)胞中 COX-2 的表達(dá),。此外，PSG-1 抑制 LPS 誘導(dǎo)的 MAPKs 信號通路激活，并通過激活 Nrf2/Keap1 信號通路調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激,。同時,，在腸樣 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)模型中也觀察到了類似的趨勢（圖6）。因此推測 PSG-1 不僅對 LPS 誘導(dǎo)的 RAW264.7 巨噬細(xì)胞具有直接的抗炎作用,，而且在腸樣 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)模型中也具有間接的抗炎作用,。這些發(fā)現(xiàn)為開發(fā) PSG-1 作為功能性食品或營養(yǎng)制劑中潛在的抗炎成分奠定了基礎(chǔ),。參考文獻(xiàn)：Hu X, Yu Q, Hou K, Ding X, Chen Y, Xie J, Nie S, Xie M. Regulatory effects of Ganoderma atrum polysaccharides on LPS-induced inflammatory macrophages model and intestinal-like Caco-2/macrophages co-culture inflammation model. Food Chem Toxicol. 2020 Jun;140:111321. doi: 10.1016/j.fct.2020.111321. Epub 2020 Apr 11. PMID: 32289334.
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