炎癥是機體受到外界微生物入侵后的一種保護性反應,。作為影響最大的炎癥誘導劑,，內毒素脂多糖（LPS）為革蘭氏陰性菌外膜中的脂多糖成分,。巨噬細胞通過產生促炎細胞因子被 LPS 激活,，其他炎癥介質包括活性氧（ROS）,、前列腺素E2（PGE2）和誘導型環(huán)氧合酶-2（COX-2）,。此外，參與控制炎癥的另一個途徑是核轉錄因子紅系2相關因子2（Nrf2）,。大量研究表明,，Nrf2 有助于預防多種疾病，包括癌癥,、心血管疾病,、神經退行性疾病和炎癥。腸道不僅是人體重要的消化吸收器官,，也是最大的免疫器官,。腸上皮細胞和各種免疫細胞分布在腸黏膜內，包括巨噬細胞,、樹突狀細胞和上皮內淋巴細胞,，在腸黏膜免疫中發(fā)揮重要作用。巨噬細胞作為先天免疫的效應細胞,，在腸道固有層中吞噬和清除細菌并分泌細胞因子,，從而維持腸道環(huán)境的穩(wěn)定。Caco-2 細胞模型不僅可用于研究腸道吸收和轉運機制,，還可用于體外研究腸黏膜上皮細胞的分泌和屏障功能,。細胞共培養(yǎng)模型可以模擬體內微環(huán)境，在一定程度上彌補了單層細胞培養(yǎng)對生理環(huán)境模擬的不足,。上皮細胞與免疫細胞的共培養(yǎng)是體外研究腸上皮細胞與黏膜內免疫細胞相互作用機制的有力方法,。因此，南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室課題組的一項研究通過 LPS 處理建立 RAW264.7 巨噬細胞和腸上皮樣 Caco-2 細胞的共培養(yǎng)模型,，以模擬炎癥性腸道環(huán)境,。靈芝是一種藥食兩用的菌類。研究人員實驗室分離出一種主要的多糖成分,，命名為靈芝多糖（PSG-1）,，純度>99.8%。已發(fā)現(xiàn) PSG-1 具有多種生物活性,，例如抗腫瘤活性,、化學保護作用和免疫調節(jié)作用。該研究旨在探討 PSG-1 對 LPS 誘導的炎癥巨噬細胞模型和 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)炎癥模型的直接和間接調控作用，旨在闡明其抗炎作用的潛在機制,。PSG-1 降低 LPS 誘導的 RAW264.7 巨噬細胞和腸樣 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)模型中細胞因子的分泌實驗先測定 LPS 誘導的 RAW264.7 巨噬細胞和腸樣 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)模型中細胞因子的產生,，以檢測 PSG-1 的抗炎作用。首先確定在 LPS 誘導的 RAW264.7 巨噬細胞和腸樣 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)模型中,，PSG-1 是否可以抑制 LPS 誘導的 TNF-α,、IL-6、IL-1β 的分泌,。與未刺激的細胞相比,，LPS 顯著增加了 LPS 誘導的 RAW264.7 巨噬細胞中 TNF-α、IL-6 和 IL-β 的分泌,。然而,，當 PSG-1 與 LPS 處理的 RAW264.7 巨噬細胞共培養(yǎng)時，PSG-1 處理（160 μg/mL）使這三種促炎細胞因子的分泌分別減少了 60.5%,、32.1%,、46.1%。在模擬腸道炎癥的 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)模型中,，還分析了促炎細胞因子的分泌,。在 PSG-1 存在下，腸樣 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)模型中,，炎癥刺激后測量 TNF-α,、Il-6、IL-1β 的水平,。PSG-1 降低 LPS 誘導的 RAW264.7 巨噬細胞和腸樣 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)模型中細胞內 ROS 的產生
ROS 的過量產生導致氧化應激,，損傷與炎癥相關的疾病中的細胞和組織。為了探索 PSG-1 對氧化應激的特性,，通過流式細胞術檢測細胞內 ROS 的產生,。當 RAW264.7 巨噬細胞用 LPS 刺激時，細胞內 ROS 的產生增加且上調顯著,，而 PSG-1+LPS 聯(lián)合處理時這些效應呈濃度依賴性減弱（分別為 47.9%, 75.8 %,、94.3%）。類似的趨勢出現(xiàn)在腸樣 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)炎癥模型中,，PSG-1 減少 LPS 刺激的共培養(yǎng)炎癥模型中的 ROS 產生,。
PSG-1 抑制 LPS 誘導的 COX-2 表達的激活為了研究 PSG-1 的潛在抗炎作用，通過蛋白質印跡分析確定了 COX-2 的表達,。對照組很少檢測到 COX-2 的表達,。然而，LPS 處理后表達顯著上升,，在 LPS 刺激的 RAW264.7 巨噬細胞（20.3%,、55.9%,、56.2%）或腸樣 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)模型（38.1%、57.7%,、60.5%）中,，用 PSG-1 處理 RAW264.7 巨噬細胞或腸樣 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)模型均以濃度依賴性方式抑制了 LPS 誘導的 COX-2 水平。PSG-1 抑制 LPS 誘導的 MAPKs 信號通路激活炎癥介質的產生也受 MAPKs 控制,。使用蛋白質印跡分析檢測 PSG-1 對 RAW264.7 巨噬細胞和腸樣 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)模型中 LPS 誘導的 Erk1/2、JNK 和 p38 MAPK 磷酸化的影響,。LPS 刺激顯著增加 RAW264.7 巨噬細胞中磷酸化的 ERK,、JNK 和 p38 表達。同時,，PSG-1 顯著抑制 LPS 誘導的 Erk1/2,、JNK 和 p38 磷酸化。PSG-1 在腸樣 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)模型中抑制 LPS 誘導的 Erk1/2,、JNK 和 p38 磷酸化,。PSG-1 調節(jié) Nrf2/keap1 介導的氧化應激信號通路Nrf2/kelch 樣 ECH 相關蛋白1（Keap1）信號通路的蛋白質表達是在 LPS 單獨刺激或在 RAW264.7 巨噬細胞和腸樣 Caco-2/RAW264 中存在 PSG-1 的情況下測定的。在 LPS 誘導的 RAW264.7 巨噬細胞中,，實驗發(fā)現(xiàn)與對照組相比,，LPS 刺激降低了 Nrf2 的表達，而與 LPS 組相比,，在 80 或 160 μg/mL 劑量下與 PSG-1 聯(lián)合使用可顯著提高（42.3%,、25.8%）Nrf2 的活性。同時,，如在 LPS 刺激的腸樣 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)模型中觀察到的（圖5 B）,，LPS 刺激誘導 Nrf2 表達的顯著下調，在 LPS 誘導 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)模型（30.7%, 106%）中,，PSG-1 處理（40, 160 μg/mL）后 Nrf2 水平顯著升高,。此外在 LPS 誘導的 RAW264.7 巨噬細胞中，暴露于 LPS 后 Keap1 的蛋白水平降低,，而 LPS+PSG-1 處理較 LPS 組相比,，Keap1 顯著上調（33.0%、78.8%,、31.7%）,。腸樣 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)模型僅用 LPS 處理時，Keap1 的表達減少,。然而,，PSG-1 處理顯著上調 LPS 誘導的 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)模型中 Keap1 的表達（34.4%、41.2%,、103.0%）,。總之，該研究證明 PSG-1 降低 LPS 誘導的促炎細胞因子（TNF-α、IL-6 和 IL-1β）的分泌和 ROS 水平,，并抑制 LPS 誘導的 RAW264.7 巨噬細胞中 COX-2 的表達,。此外，PSG-1 抑制 LPS 誘導的 MAPKs 信號通路激活,，并通過激活 Nrf2/Keap1 信號通路調節(jié)氧化應激,。同時，在腸樣 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)模型中也觀察到了類似的趨勢（圖6）,。因此推測 PSG-1 不僅對 LPS 誘導的 RAW264.7 巨噬細胞具有直接的抗炎作用,，而且在腸樣 Caco-2/RAW264.7 共培養(yǎng)模型中也具有間接的抗炎作用。這些發(fā)現(xiàn)為開發(fā) PSG-1 作為功能性食品或營養(yǎng)制劑中潛在的抗炎成分奠定了基礎,。參考文獻：Hu X, Yu Q, Hou K, Ding X, Chen Y, Xie J, Nie S, Xie M. Regulatory effects of Ganoderma atrum polysaccharides on LPS-induced inflammatory macrophages model and intestinal-like Caco-2/macrophages co-culture inflammation model. Food Chem Toxicol. 2020 Jun;140:111321. doi: 10.1016/j.fct.2020.111321. Epub 2020 Apr 11. PMID: 32289334.
小編旨在分享,、學習、交流生物科學等領域的研究進展,。如有侵權或引文不當請聯(lián)系小編修正,。關注公眾號“Naturethink"了解更多體外細胞共培養(yǎng)技術及應用！
8
