椎間盤退行性變（IVD）是導(dǎo)致腰痛（LBP）的主要原因，已成為影響人類生活的全球性社會(huì)問題,。目前，椎間盤退變的治療方法有保守治療和和脊柱手術(shù)減壓,，旨在減輕疼痛,，讓患者恢復(fù)工作,。然而，這兩種策略都不能有效治療 IVD 變性,。目前，干細(xì)胞療法成為修復(fù) IVD 退行性病變的新治療策略,。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）可以分化為髓核（NP）樣細(xì)胞并促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的合成,，在治療 IVD 變性方面表現(xiàn)出巨大的潛力。近年來發(fā)現(xiàn),，MSCs 存在于 NP 組織中，這些髓核間充質(zhì)干細(xì)胞（NP-MSCs）有效地修復(fù)了 NP 組織,。許多研究表明，IVD-MSCs 數(shù)量和功能的喪失與 IVD 退行性密切相關(guān),。機(jī)械應(yīng)力是 IVD 退變的重要誘因。一般來說,，IVD 在日常生活中經(jīng)歷各種機(jī)械壓力,。有研究報(bào)道,，過度壓力導(dǎo)致椎間盤退變與椎間盤細(xì)胞的活性和凋亡的發(fā)生密切相關(guān)，壓力會(huì)通過誘導(dǎo)髓核細(xì)胞凋亡導(dǎo)致椎間盤退變,。近年來,，有研究顯示壓力不僅會(huì)導(dǎo)致髓核干細(xì)胞凋亡，還能影響髓核干細(xì)胞的生物學(xué)行為,。因此，在椎間盤內(nèi)壓力等不利微環(huán)境下,，如何減少髓核干細(xì)胞的死亡,，將成為椎間盤退變的一種重要的治療策略,。吡格列酮被認(rèn)為是過氧化物酶體增殖物激活受體γ激活劑，用于治療糖尿病,，其可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝,、能量平衡等。研究報(bào)道,，吡格列酮通過抗氧化應(yīng)激保護(hù)胰腺細(xì)胞免受棕櫚酸誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性,，還能通過改變 Bcl-2 表達(dá)和 caspase-3 活化來減輕由 TNF -α 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡或細(xì)胞應(yīng)激水平,。此外，吡格列酮能緩解糖基化晚期終末產(chǎn)物誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡,，治療骨關(guān)節(jié)炎。然而,，吡格列酮對(duì)壓縮誘導(dǎo)的 NP-MSCs 死亡的影響仍然未知,。華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院骨科,、心內(nèi)科，附屬同濟(jì)醫(yī)院血液內(nèi)科的一項(xiàng)研究中,，采用不同的方法來評(píng)估吡格列酮對(duì)壓力誘導(dǎo)的 NP-MSCs 凋亡的保護(hù)作用，通過檢測(cè)氧化應(yīng)激水平和線粒體功能以及線粒體凋亡相關(guān)蛋白,，評(píng)估線粒體途徑在吡格列酮保護(hù)壓力誘導(dǎo)的 NP-MSCs 凋亡中的作用,。
為了研究吡格列酮對(duì)壓縮暴露的 NP-MSCs 的影響,，細(xì)胞用不同濃度的吡格列酮（0 μM、10? μM,、20? μM,、50? μM和 100? μM）處理并暴露于 1.0 MPa 壓縮力下持續(xù)36 小時(shí),，用于隨后實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組細(xì)胞（con）表示無藥物,、無壓力。吡格列酮減輕壓力對(duì)細(xì)胞活力和細(xì)胞增殖的抑制作用進(jìn)行 CCK-8 測(cè)定以確定 NP-MSCs 的活性,。結(jié)果表明，吡格列酮對(duì) NP-MSCs 無細(xì)胞毒性（圖1 a）,。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，壓縮顯著降低了細(xì)胞活性,。為了研究吡格列酮對(duì) NP-MSCs 的保護(hù)作用，用不同濃度的吡格列酮處理 NP-MSCs,，發(fā)現(xiàn)吡格列酮顯著減輕了壓縮對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用，并且在100 μM 的劑量下保護(hù)作用明顯（圖1 b）,。此外,，使用 EdU 摻入法檢測(cè)細(xì)胞增殖,。結(jié)果表明，吡格列酮組 EdU 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（紅色熒光）多于加壓組（圖1 c）,。這證明，吡格列酮顯著減輕了壓力對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用,。
圖1 吡格列酮對(duì) NP-MSCs 活力和增殖的影響,。
（a）CCK-8 測(cè)定用于評(píng)估不同濃度的吡格列酮（0,、10,、20,、50,、100 μM）對(duì)NP-MSCs 細(xì)胞活力的影響。（b）CCK-8 測(cè)定用于評(píng)估吡格列酮對(duì)壓力介導(dǎo)的 NP-MSCs 活力的影響,。Con 作為對(duì)照組。（c）熒光顯微鏡下 EdU 染色的代表性顯微照片,。紅色熒光表示 EdU 陽(yáng)性細(xì)胞（200x）,。
吡格列酮可防止 NP-MSCs 中的壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性鬼筆環(huán)肽用于檢測(cè) NP-MSCs 的肌動(dòng)蛋白絲,。結(jié)果表明，壓力明顯破壞了肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維,，吡格列酮挽救了壓力造成的不良后果。隨后,，檢測(cè)乳酸脫氫酶（LDH）的釋放。結(jié)果表明,，與對(duì)照組相比，壓力顯著促進(jìn)了 LDH 的釋放,。吡格列酮顯著逆轉(zhuǎn)壓縮力誘導(dǎo)的 LDH 釋放。
為了進(jìn)一步評(píng)估吡格列酮對(duì)壓縮誘導(dǎo)的 NP-MSCs 細(xì)胞毒性的保護(hù)作用,，使用Calcein-AM / PI 染色在熒光顯微鏡下量化活/死細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),，吡格列酮組中的活細(xì)胞（綠色熒光）較多，而加壓組中的死細(xì)胞（紅色熒光）較多,。這表明，吡格列酮可保護(hù) NP-MSCs 免受壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性,。
吡格列酮對(duì)壓力誘導(dǎo)的 NP-MSCs 凋亡的保護(hù)作用
為了探索吡格列酮對(duì)壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用,，使用 Annexin V-FITC/PI 雙染色來檢測(cè) NP-MSCs 的細(xì)胞凋亡,。結(jié)果顯示，壓力誘導(dǎo)了 NP-MSCs 凋亡,。吡格列酮可顯著保護(hù)壓力誘導(dǎo)的 NP-MSCs 凋亡。為了進(jìn)一步檢查吡格列酮的保護(hù)作用,，使用 TUNEL 染色在熒光顯微鏡下研究細(xì)胞凋亡的變化。TUNEL 染色顯示,，吡格列酮組 TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞較壓力組明顯減少。這表明,，吡格列酮對(duì)壓力誘導(dǎo)的 NP-MSCs 凋亡具有保護(hù)作用。
吡格列酮降低 NP-MSCs 中的壓力誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激
氧化應(yīng)激水平的升高導(dǎo)致線粒體功能障礙并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,。為了研究吡格列酮對(duì) NP-MSCs 氧化應(yīng)激的影響，實(shí)驗(yàn)使用 DCFH-DA 熒光探針檢測(cè) ROS 的產(chǎn)生來評(píng)估 NP-MSCs 的氧化應(yīng)激水平,。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比,，壓力顯著增加了細(xì)胞內(nèi) ROS 的產(chǎn)生。吡格列酮可顯著降低壓力誘導(dǎo)的 ROS 產(chǎn)生,。此外，還通過 MDA 檢測(cè)試劑盒評(píng)估了氧化應(yīng)激水平,。數(shù)據(jù)顯示，吡格列酮顯著降低了壓力誘導(dǎo)的髓核干細(xì)胞內(nèi) MDA 的較高表達(dá),。這表明，吡格列酮減輕了 NP-MSCs 中壓力誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激水平,。
吡格列酮減輕 NP-MSCs 中壓力誘導(dǎo)的線粒體損傷
線粒體損傷是線粒體凋亡途徑中的一個(gè)重要因素。當(dāng)發(fā)生線粒體膜電位（MMP）損傷時(shí),，JC-1 從 JC-1 聚合物（紅色熒光）轉(zhuǎn)變?yōu)?JC-1 單體（綠色熒光）,。為了評(píng)估吡格列酮對(duì) NP-MSCs 中壓力誘導(dǎo)的線粒體損傷的保護(hù)作用，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行 JC-1 染色,，流式細(xì)胞術(shù)分析檢測(cè) NP-MSCs 中的 MMP。結(jié)果發(fā)現(xiàn),，與壓力組相比，壓力降低了 NP-MSCs 中的紅/綠比,，吡格列酮顯著增加了紅/綠比。另外用熒光顯微鏡觀察吡格列酮的保護(hù)作用,。在加壓組中，NP-MSCs 的紅色熒光較少,，綠色熒光較多,，而吡格列酮可以增加紅色熒光,，減少綠色熒光。同時(shí)應(yīng)用透射電鏡 TEM 直觀地觀察 NP-MSCs 的超微結(jié)構(gòu),。當(dāng) NP-MSCs 受壓時(shí),，細(xì)胞核皺縮,，出現(xiàn)凋亡小體，線粒體數(shù)量明顯減少,，大量的脂滴形成,。幸運(yùn)的是,，吡格列酮可以顯著減輕 NP-MSCs 超微結(jié)構(gòu)的損傷。與壓力組相比,，吡格列酮組中細(xì)胞核相對(duì)完整，線粒體數(shù)量和形態(tài)均有所改善,。
吡格列酮對(duì)加壓下 NP-MSCs 線粒體凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響為了研究吡格列酮對(duì)壓力誘導(dǎo)的線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白表達(dá)變化的影響,，實(shí)驗(yàn)使用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),。結(jié)果顯示,，與吡格列酮組相比，加壓組抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表達(dá)降低,，而促凋亡蛋白 Bax 的表達(dá)增加,。此外發(fā)現(xiàn),，壓力能促進(jìn) cytochrome c 的表達(dá)，并進(jìn)一步活化 caspase-9,，從而激活 caspase-3,，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,。然而，吡格列酮顯著逆轉(zhuǎn)了這些影響,。此外對(duì)蛋白質(zhì)水平進(jìn)行了定量分析,。該研究的結(jié)果表明,，吡格列酮通過抑制氧化應(yīng)激和線粒體損傷來減輕壓力誘導(dǎo)的 NP-MSC 凋亡。吡格列酮對(duì)壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的潛在分子保護(hù)機(jī)制涉及線粒體途徑,。總之,，這些發(fā)現(xiàn)將進(jìn)一步豐富椎間盤退變的治療方法,，為椎間盤退變的治療提供理論基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)：Hu Y, Huang L, Shen M, Liu Y, Liu G, Wu Y, Ding F, Ma K, Wang W, Zhang Y, Shao Z, Cai X, Xiong L. Pioglitazone Protects Compression-Mediated Apoptosis in Nucleus Pulposus Mesenchymal Stem Cells by Suppressing Oxidative Stress. Oxid Med Cell Longev. 2019 Nov 22;2019:4764071. doi: 10.1155/2019/4764071. PMID: 31885796; PMCID: PMC6893265.小編旨在分享,、學(xué)習(xí)、交流生物科學(xué)等領(lǐng)域的研究進(jìn)展,。如有侵權(quán)或引文不當(dāng)請(qǐng)聯(lián)系小編修正。歡迎關(guān)注公眾號(hào)“Naturethink"了解更多體外仿生培養(yǎng)知識(shí),！
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