Transwell小室共培養(yǎng)條件下內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)成骨細(xì)胞增殖、凋亡的影響

時(shí)間：2021/7/23閱讀：4118

在科技快速發(fā)展的今天,，我國(guó)醫(yī)療體系已得到健全發(fā)展,。但是骨質(zhì)疏松治療和骨折修復(fù)仍然是一道醫(yī)學(xué)難題。骨質(zhì)疏松癥先有被稱(chēng)為無(wú)聲的“殺手“,，后有"靜悄悄的流行病",，它和中風(fēng)相似，喜歡無(wú)聲無(wú)息地侵襲著人們?，F(xiàn)階段如何促進(jìn)和維持骨的生成成為了治療骨質(zhì)疏松的主要解決問(wèn)題,。

針對(duì)上述的問(wèn)題，來(lái)自空軍軍醫(yī)大學(xué)航空航天醫(yī)學(xué)系航空航天醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的李高志課題組和其他課題組合作研究,，共同探索了在共培養(yǎng)條件下,，微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3對(duì)成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖、凋亡的影響,。文章題目為《Transwell小室共培養(yǎng)條件下微血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)成骨細(xì)胞增殖,、凋亡的影響》。

在最終的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在Transwell小室共培養(yǎng)條件下,，微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3能夠顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞MC3T3-E1的增殖,，并抑制其凋亡。為骨質(zhì)疏松和骨折修復(fù)的醫(yī)學(xué)研究提供了突破口,。

在介紹實(shí)驗(yàn)之前,，我們先了解微血管內(nèi)皮細(xì)胞的基本功能,，微血管內(nèi)皮細(xì)胞是內(nèi)襯于血管內(nèi)壁的一層細(xì)胞,，它不僅是血管內(nèi)屏障的重要組成部分，而且在調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)穩(wěn)定,、維持正常生理的免疫功能方面起到重要的作用,。

骨骼內(nèi)的微血管內(nèi)皮細(xì)胞還可以分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的功能和新骨形成。因此,，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞與成骨細(xì)胞之間的調(diào)控具有重要的醫(yī)學(xué)價(jià)值,。

細(xì)胞共培養(yǎng)指兩種或者多種細(xì)胞在一起條件下共同培養(yǎng),。可更好模擬體內(nèi)環(huán)境,，這種方法被廣泛運(yùn)用于細(xì)胞之間相互調(diào)控的研究,。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.MC3T3-E1/bEnd.3細(xì)胞共培養(yǎng)體系的建立

取復(fù)蘇后3 ~ 6 代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MC3T3-E1細(xì)胞，胰酶消化制成單細(xì)胞懸液,，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),，將細(xì)胞密度調(diào)整至2×105/mL后將1 mL 細(xì)胞懸液均勻接種于6孔板。利用孔徑0.4 µm 的Transwell小室建立非接觸的細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng),。

取復(fù)蘇后3 ~ 6 代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的bEnd.3細(xì)胞,，胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，進(jìn) 行細(xì) 胞計(jì) 數(shù) ,，將細(xì) 胞密度調(diào) 整至2×105/mL后將 1 mL 細(xì) 胞懸液均勻接種于Transwell小室內(nèi)底面,。然后將接種有bEnd.3細(xì)胞的Transwell小室插入接種有MC3T3-E1細(xì)胞的6孔板中，建立MC3T3-E1和bEnd.3的1∶1比例的細(xì)胞共培養(yǎng)體系,。

單獨(dú)培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞,，孔中不置入小室。兩者均使用共培養(yǎng)培養(yǎng)基(DMEM高糖培養(yǎng)基與α-MEM培養(yǎng)基混合,，比例為1∶1,，含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素溶液)，置于37℃孵箱中,，保持5% CO2 濃度,，每2 d換液1次。

2.實(shí)驗(yàn)分組

對(duì)照組：?jiǎn)为?dú)培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞,；共培養(yǎng)組：MC3T3-E1細(xì)胞+ bEnd.3 細(xì)胞,，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

1,、共培養(yǎng)條件下微血管內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖,。

在共培養(yǎng) 0 h、24 h,、48 h,、72 h 的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)兩組MC3T3-E1細(xì)胞樣本進(jìn)行CCK-8檢測(cè)(圖1),。從生長(zhǎng)曲線可以看出,，對(duì)照組和共培養(yǎng)組 MC3T3-E1 細(xì)胞的細(xì)胞活性均隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加，但共培養(yǎng)組 MC3T3-E1 細(xì)胞的細(xì)胞活性增加更明顯,，并且在共培養(yǎng) 48 h 和 72 h 兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P < 0.05),。

PI 單染流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果表明，與 bEnd.3 共培養(yǎng)之后，MC3T3-E1 細(xì)胞周期中 3 個(gè)時(shí)期的比例出現(xiàn)顯著變化,。

Western blotting 的結(jié)果證實(shí) ,，與 bEnd.3 共培養(yǎng)之后，MC3T3-E1 細(xì)胞的 PCNA 蛋白表達(dá)水平顯著升高 (P < 0.01),，表明 MC3T3-E1細(xì)胞的增殖能力較對(duì)照組顯著增強(qiáng),。

2、共培養(yǎng)條件下微血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制成骨細(xì)胞的凋亡 ,。

Annexin V-FITC/PI 雙染流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明 (圖 4),，與bEnd.3 共培養(yǎng)之后，MC3T3-E1細(xì)胞的凋亡率顯著下降 (P < 0.05),。

與 bEnd.3 共培養(yǎng)之后,，MC3T3-E1細(xì)胞的凋亡率顯著下降 (P < 0.05)。采用 Westernblotting 檢測(cè)凋亡相關(guān)因子 Bax,、Cleaved Caspase-3的表達(dá)變化 ,，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比,，共培養(yǎng)組 MC3T3-E1 細(xì)胞 Bax,、Cleaved Caspase-3 的表達(dá)水平顯著降低 (P<0.05)。

上述結(jié)果顯示,，在Transwell 共培養(yǎng)條件下,，bEnd.3 能夠抑制 MC3T3-E1 細(xì)胞的凋亡。

本研究利用 Transwell 小室 ,，構(gòu) 建 bEnd.3/MC3T3-E1 共培養(yǎng)體系,。研究表明，在 Transwell 小室共培養(yǎng)條件下,，微血管內(nèi)皮細(xì)胞 bEnd.3 能夠顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞MC3T3-E1 的增殖,，并抑制其凋亡。這為防治骨質(zhì)疏松,、構(gòu)建血管化組織工程骨選擇合適的微血管內(nèi)皮細(xì)胞提供了理論依據(jù),，并進(jìn)一步加深了微血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)成骨細(xì)胞功能調(diào)控的理解。

參考文獻(xiàn)：[1]李高志,張麗君,王藝璇,徐麗群,胡澤兵,石菲,張舒,曹新生.Transwell小室共培養(yǎng)條件下微血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)成骨細(xì)胞增殖,、凋亡的影響[J].

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