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液相色譜柱的正反向
液相色譜的柱子通常分為正相柱和反相柱,。正相柱大多以硅膠為柱,，或是在硅膠表面鍵合-CN,-NH3等官能團(tuán)的鍵合相硅膠柱;反相柱填料主要以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合非極性的十八烷基官能團(tuán)（ODS）稱為C18柱,，其它常用的反相柱還有C8,C4,C2和苯基柱等,。另外還有離子交換柱，GPC柱,，聚合物填料柱等,。本文重點(diǎn)介紹反相色譜柱的選擇和使用：
一、反相色譜柱的選擇
1.柱子的PH值使用范圍
反相柱優(yōu)點(diǎn)是固定相穩(wěn)定,，應(yīng)用廣泛,，可使用多種溶劑。但硅膠為基質(zhì)的填料,，使用時一定要注意流動相的PH范圍,。一般的C18柱PH值范圍都在2-8，流動相的PH值小于2時,，會導(dǎo)致鍵合相的水解;當(dāng)PH值大于7時硅膠易溶解;經(jīng)常使用緩沖液固定相要降解,。一旦發(fā)生上述情況，色譜柱人口處會塌陷,。同樣填料各種不同牌號的色譜柱不盡相同,。如果流動相PH較高或經(jīng)常使用緩沖液時，建議選擇PH范圍大的柱子,，例如戴安公司的Acclaim柱PH 2-9或Zorbax的PH 2-11. 5的柱子,。
2.填料的端基封尾（或稱封口）
把填料的殘余硅羥基采用封口技術(shù)進(jìn)行端基封尾，可改善對極性化合物的吸附或拖尾;含碳量增高了,，有利于不易保留化合物的分離;填料穩(wěn)定性好了,，組分的保留時間重現(xiàn)性就好。如果待分析的樣品屬酸性或堿性的化合物,，選用填料經(jīng)端基封尾的色譜柱,。
二、液相色譜柱的使用
色譜柱在使用前,，進(jìn)行柱的性能測試,，并將結(jié)果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考,。在做柱性能測試時要按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行（出廠測試所使用的條件是*條件）,，只有這樣，測得的結(jié)果才有可比性,。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品,、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同,。
1,、樣品的前處理
a、使用流動相溶解樣品,。
b,、使用預(yù)處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì),。
c,、使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì),。
2,、流動相的配制
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的,，因此要求流動相具備以下的特點(diǎn)：
a,、流動相對樣品具有一定的溶解能力,，保證樣品組分不會沉淀在柱中（或長時間保留在柱中）。
b,、流動相與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)c,、流動相的黏度要盡量小,，以便得到好的分離效果;降低柱壓降，延長泵的使用壽命（可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動相的黏度）,。
d,、流動相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng)。如使用UV檢測器,，使用對紫外吸收較低的溶劑配制,。
e,、流動相沸點(diǎn)不要太低,，否則容易產(chǎn)生氣泡,，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。
f、在流動相配制好后,，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測,，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。
3,、流動相流速的選擇
因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù),，使用不同的流速可得到不同的柱效,。對于一根特定的色譜柱,，要追求*柱效,，使用*流速。對內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱,，流速一般選擇1ml/min,，對于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml/min為佳,。
當(dāng)選用*流速時,，分析時間可能延長?？刹捎酶淖兞鲃酉嗟南礈鞆?qiáng)度的方法以縮短分析時間（如使用反相柱時,，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量）。
注意：
a.含水流動相在實(shí)驗(yàn)前配制,，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動相不要過夜,。加入*，防止細(xì)菌生長,。
b.流動相要求使用0.45 μm濾膜過濾,，除去微粒雜質(zhì)。
c.使用HPLC級溶劑配制流動相,，使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命,，提高柱性能。
三. 色譜柱的維護(hù)
1. 色譜柱的平衡
反相色譜柱由工廠測試后是保存在乙腈/水中的,。新柱應(yīng)先使用10-20倍柱體積的甲醇或乙腈沖洗色譜柱,。請一定確保您分析樣品所使用的流動相和乙腈/水互溶。每天用足夠的時間以流動相來平衡色譜柱,，您就會在處理問題方面獲得zui大的"補(bǔ)償",，而且您的色譜柱的壽命也會變得更長!操作步驟：
a. 平衡開始時將流速緩慢地提高，用流動相平衡色譜柱直到獲得穩(wěn)定的基線（緩沖鹽或離子對試劑流速如果較低,，則需要較長的時間來平衡）
b. 如果使用的流動相中含有緩沖鹽,，應(yīng)注意用純水"過渡"即每天分析開始前必須先用純水沖洗30分鐘以上再用緩沖鹽流動相平衡; 分析結(jié)束后必須先用純水沖洗30分鐘以上除去緩沖鹽之后再用甲醇沖洗30分鐘保護(hù)柱子。
2. 色譜柱的再生
長期使用的色譜柱,，往往柱效會下降（柱子的理論塔板數(shù)減低）,。可以對色譜柱進(jìn)行再生,，在有條件的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)使用一個廉價的泵進(jìn)行柱子的再生,。
建議用來沖洗柱子的溶劑體積
色譜柱尺寸 柱體積 所用溶劑的體積
125-4mm 1.6ml 30ml
250-4 mm 3.2ml 60ml
250-10mm 20ml 400ml
選擇再生方法：
極性固定相（如Si，NH2* ，DIOL基色譜填料）的再生：
正庚烷→→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水**
非極性固定相（如反相色譜填料RP-18,，RP-8,，CN等）的再生： 水→乙腈→（或異丙醇）→乙腈→水
注意：
a. 在對NH2改性的色譜柱進(jìn)行再生時，由于NH2可能以銨根離子的形式存在,，因此應(yīng)該在水洗后用0.1M的氨水沖洗,，然后再用水沖洗至堿溶液*流出稀硫酸可以用來清洗已污染的色譜柱，如果簡單的用有機(jī)溶劑/水的處理不能夠*洗去硅膠表面吸附的雜質(zhì),，在水洗后加用0.05M稀硫酸沖洗非常有效,。
3. 色譜柱的維護(hù)
a.使用預(yù)柱保護(hù)分析柱（硅膠在極性流動相/離子性流動相中有一定的溶解度）
b.大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是2-7.5，盡量不超過該色譜柱的pH范圍
c.避免流動相組成及極性的劇烈變化
d.流動相使用前必須經(jīng)脫氣和過濾處理
e.如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動相,，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)完畢柱子沖洗干凈,，并保存于甲醇或乙腈中
f.氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性，故使用時要注意,，柱及連接管內(nèi)不能長時間存留此類溶劑,，以避免腐蝕