脫氫抗壞血酸還原酶（dehydroascorbate reductase,，DHAR）試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

注意：正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定,。

測定意義：

DHAR 存在于細(xì)胞質(zhì)、線粒體和葉綠體中,。DHAR 催化 GSH 還原 DHA 生成 AsA 和 GSSG,，調(diào)控細(xì)胞 AsA/DHA 比值，是抗壞血酸-谷胱甘肽氧化還原循環(huán)的關(guān)鍵酶,。提高植物體內(nèi)的 DHAR 活性,，可提高植物食品中 AsA 含量，進而提高植物食品的營養(yǎng)品質(zhì)。

測定原理：

DHAR 催化 GSH 還原 DHA 生成 AsA,，通過測定 DHA 減少速率,，計算 DHAR 活性。

實驗中所需儀器及設(shè)備：

研缽,、冰,、低溫離心機,、紫外分光光度計,、1mL 石英比色皿、可調(diào)式移液器和蒸餾水,。

試劑組成和配制：

試劑一：液體 50 mL×1 瓶,，4℃保存。

試劑二：液體 35 mL×1 瓶,，4℃保存,。

試劑三：粉劑×1 瓶（棕色），4℃保存,。臨用前加入 5mL 蒸餾水充分溶解,。

試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存,。臨用前加入 5mL 蒸餾水充分溶解,。

粗酶液提取：

1. 按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織,，加入 1mL 試劑一）進行冰浴勻漿,。8000g，4℃離心 10min,，取上清置冰上待測,。

2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議

500 萬細(xì)胞加入 1mL 試劑一）,，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w,，超聲 3 秒，間隔 7 秒,，總時間 3min）,；8000g 4℃離心 20min，取上清液置冰上混勻待測,。

3. 血清等液體：直接測定,。

DHAR 測定操作：

1. 分光光度計預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長到 265nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2. 試劑二在 25℃水浴鍋中預(yù)熱 30 min。

3. 在 1mL 石英比色皿中依次加入 100μL 上清液,、100μL 試劑三,、100μL 試劑四和 700μL 試劑二,，迅速混勻后于 265nm 比色，記錄 30s 和 150s 的吸光值 A1 和 A2,，△A=A2-A1,。

DHAR 活性計算公式：

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘還原生成 1nmol AsA 為 1 個酶活單位。 DHAR(nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷(Cpr×V 樣)÷T

= 92×△A ÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘還原生成 1nmol AsA 為 1 個酶活單位,。

DHAR(nmol/min/g 鮮重) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

= 92×△A ÷W

(3). 按細(xì)胞數(shù)量計算

活性單位定義：25℃中每 10⁴ 個細(xì)胞每分鐘還原生成 1nmol AsA 為 1 個酶活單位,。

DHAR(nmol/min/10⁴ cell) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T

= 92×△A ÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

活性單位定義：25℃中每毫升樣本每分鐘還原生成 1nmol AsA 為 1 個酶活單位。

DHAR(nmol/min/mL) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷V 樣÷T

= 92×△A

ε ：AsA 在 265nm 處摩爾吸光系數(shù)為 5.42×10⁴ L/mol /cm,；10⁹：摩爾分子換算成納摩爾分子,；d：比色杯光徑，1 cm,；V 反總：反應(yīng)體系總體積,，1mL=0.001 L；V 樣：反應(yīng)體系中加入上清液體積,，100μL =0.1mL,；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL,；V 樣總：加入提取液體積,，1mL；W,，樣本質(zhì)量,，g；T：反應(yīng)時間,，2 min,。

注意事項：

臨用前配制的試劑未使用完的 4℃保存，3 天內(nèi)使用完,。

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