L-半乳糖酸-1,4-內酯脫氫酶（L-galacto,4-lactone dehydrogenase,，

Gal LDH）活性測定試劑盒說明書

分光光度法

50管/48樣

注意：正式測定之前選擇 2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

L-半乳糖途徑是合成 AsA的主要途徑,。Gal   LDH位于線粒體內膜,，負責催化植物體內 AsA

生物合成的zui后一步，也是該途徑的關鍵酶之一,，對植物體內 AsA含量的積累起著至關重

要的作用,。

測定原理：

Gal LDH催化 L-半乳糖內酯還原細胞色素 c（Cyt c），還原型Cyt c在  550nm有吸收峰,；測

定還原型 Cyt c增加速率,，來計算Gal LDH活性。

自備儀器和用品：

臺式離心機,、可見分光光度計,、1mL玻璃比色皿、可調式移液器,、研缽,、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1瓶,，4℃保存,。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入40mL蒸餾水,，充分溶解,。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存,。臨用前加入5mL蒸餾水,，充分溶解。

粗酶液提?。?/span>

按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL

試劑一）進行冰浴勻漿。13000g,，4℃離心10min,，取上清置冰上待測。

Gal LDH測定操作：

1.分光光度計預熱30 min,，調節(jié)波長到550nm,，蒸餾水調零。

2.試劑二在 25℃水浴鍋中預熱 30 min,。

3.依次在 1mL玻璃比色皿中加入 100μL上清液,、800μL預熱的試劑二和100μL試劑三，迅

速混勻后于 550nm比色,，記錄10s和130s的吸光值A1和A2,，△A=A2﹣A1。

Gal LDH活性計算公式：

(1).按蛋白濃度計算

Gal LDH活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘還原1μmol Cyt c為1個酶活單位,。

Gal LDH (μmol/min/mg prot) =△A÷ε÷d×V反總×106÷（Cpr×V樣）÷T

=289×△A ÷Cpr

(2).按樣本質量計算

Gal LDH活性單位定義：25℃中每克樣品每分鐘還原1μmol Cyt c為1個酶活單位,。

Gal LDH (μmol/min/g鮮重)  =△A÷ε÷d×V反總×10⁶÷（W×V樣÷V樣總）÷T

=289×△A ÷W

ε：還原型 Cyt c摩爾消光系數(shù)，17.3×10³L/  mol/cm,；d：比色皿光徑(cm),，1cm；V反總：反

應體系總體積,，1mL=0.001 L,；10⁶：1mol=1×10⁶μmol；V樣：加入反應體系中上清液體積,，

100μL=0.1mL,；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL,，蛋白質濃度需要另外測定,，建議使用本公

司蛋白質含量 BCA試劑盒；V樣總：加入提取液體積,，1mL,；W,，樣本質量，g,；T：反應

時間,，2min,。

注意事項:

試劑二和試劑三配制好后 3天內使用完,。