檸檬酸合酶（citrate synthase,，CS）試劑盒說明書

分光光度法 10 管/9 樣

測定意義：

CS（EC 2.3.3.1）廣泛存在于動物、植物,、微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體基質(zhì)中,，是三羧酸循環(huán)*個限速酶，是三羧酸循環(huán)主要調(diào)控位點之一,。

測定原理：

CS 催化乙酰 CoA 和草酰乙酸產(chǎn)生檸檬酰輔酶 A,，進一步水解產(chǎn)生檸檬酸；該反應(yīng)促使無色的 DTNB 轉(zhuǎn)變成黃色 TNB,，在 412nm 處有特征吸光值,。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、臺式離心機,、水浴鍋,、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿,、研缽,、冰和蒸餾水

試劑組成和配制：

試劑一：液體 10mL×1 瓶，-20℃保存,；

試劑二：液體 2mL×1 瓶,，-20℃保存；

試劑三：液體 0.2mL×1 支,，-20℃保存,；

試劑四：液體 10mL×1 瓶，4℃保存；

試劑五：粉劑×1 支,，4℃保存,，臨用前加入 320μL 蒸餾水，用不完的試劑仍 4℃保存,；

試劑六：粉劑×1 支,，-20℃保存，臨用前加入 320μL 蒸餾水,，用不完的試劑仍-20℃保存,；

試劑七：粉劑×1 支，-20℃保存,，臨用前加入 320μL 蒸餾水,，用不完的試劑仍-20℃保存,；

樣本的前處理：

組織,、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1. 稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細胞，加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三,，用冰浴勻漿器或研缽勻漿,。 
2. 將勻漿 600g，4℃離心 5min,。 
3. 棄沉淀,，將上清液移至另一離心管中，11000g,，4℃離心 10min,。 
4. 上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的 CS（此步可選做）,。 
5. 在步驟④中的沉淀中加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三,，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W,，超聲 3 秒,，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次）,，用于線粒體 CS 測定,。

測定步驟：

1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長至 412nm,，蒸餾水調(diào)零。

2,、將試劑四,、五、六和七在 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）孵育 5min,。

3,、樣本測定

將上述試劑按順序加入 1 mL 玻璃比色皿中,，加試劑七的同時開始計時，在 412nm 波長下記錄 20 秒時的初始吸光度 A1 和反應(yīng) 2min 后的吸光值 A2,，計算ΔA=A2-A1,。

CS 活性計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

 單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個酶活力單位。

CS（U/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1100×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度,。（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個酶活力單位,。

CS（U/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T=222.2×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個酶活力單位。

CS（U/10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V 樣÷V 樣總）÷T=0.4444×ΔA V 反總：反應(yīng)體系總體積,，9×10^-4 L,；ε：TNB 摩爾消光系數(shù)，1.36×10⁴ L / mol /cm,；d：比色皿光徑,，1cm；V 樣：加入樣本體積,，0.03 mL,；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL,；T：反應(yīng)時間,，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；500：細胞或細菌總數(shù),，500 萬。