熒光測量

   熒光信號是由對細胞進行染色的特異性熒光染料受激后發(fā)射的,。熒光波長與激發(fā)光波長不同且強度較弱,，為此就要使用濾片以濾除非熒光信號并使用靈敏的探測器。下面我們將分別進行討論,。

光源

   常用的光源有弧光燈和激光,。弧光燈的結(jié)構(gòu)簡單、價格便宜,、維修容易，但在單一譜線上的功率較弱,。激光單色性好,、功率強大、不易散焦,，但結(jié)構(gòu)復(fù)雜,、價格昂貴、維修困難,。至于選擇某種光源的某條譜線做為激發(fā)光源,，主要是依據(jù)被激發(fā)的物質(zhì)，例如細胞的自身熒光物質(zhì)或熒光染料的激發(fā)光譜而定,。光源的譜線愈接近被激發(fā)物質(zhì)的激發(fā)光譜的峰值,，所產(chǎn)生的熒光信號愈強。

1,、汞燈 弧光燈中zui常用的是汞燈,，汞燈中又以100W汞燈zui常用。汞燈的發(fā)射譜線有一個微弱的背景,，其譜線大部分在300—450nm,，550nm附近也有，由于在300nm波長的紫外范圍有一系列譜線,，所以要求用紫外激發(fā)的場合使用汞燈很是方便,。汞燈啟動容易，啟動后數(shù)分鐘就可以達到全功率輸出,，但當熄滅后需待*冷卻才可重新啟動,。某些較新型號的汞燈里面有第三個啟動電極，可以熱啟動,。

汞燈點火后內(nèi)部壓力可達40大氣壓,，所以外部必須有可靠的屏蔽，未冷卻下來的汞燈不可折卸,，調(diào)換汞燈時要十分當心,。汞燈的缺點之一是44nm—540nm間無可以利用的譜線，這妨礙了某些熒光染料的使用,。

2,、激光  激光與普通光線不同；激光是受激輻射,，普通光線是自發(fā)輻射,。激光基本是沿著直線傳播，發(fā)散角很小，通常在10-6球面度量級的立體角內(nèi),，必要時很容易聚焦到與細胞同一數(shù)量級,。激光的亮度高，即在單位面積,、單位立體角內(nèi)輸出功率特別大,。激光還具有良好的單色性，這些特點都是汞燈所不具備的,。

    流式細胞術(shù)中使用的多為氬離子激光器,，亦有用氪離子激光器或染料激光器以獲得不同的譜線者。氬離子激光器是一種氣體激光器,，其頻率穩(wěn)定性高,、相干性好，壽命長,。它是通過氣體放電使氬離子電離并激發(fā),，實現(xiàn)粒子數(shù)反轉(zhuǎn)而產(chǎn)生激光，譜線有十余條,，其中綠光514nm和藍光488兩條譜線增強,，幾乎占總輸出功率的80%。由于這種激光在氣體放電過程中要氏氬原子一次電離必須供給相當大的能量,，所以要求有幾百伏和每平方毫米幾個安培的穩(wěn)定電源,。

     激光器的結(jié)構(gòu)，放電管由內(nèi)徑3mm氧化鈹毛細管做成,，內(nèi)充0.7mm汞柱的氬氣同時架上0.1特斯拉的軸向磁場,。此磁場的作用是對帶電粒子起約束作用，結(jié)果提高了放電區(qū)中心的電子密度和離子密度,，從而提高了輸出功率,。色散棱鏡用來選擇激光波長，使得除某一特定波長之外其他波長的損耗都非常大,，只要調(diào)整反射鏡的角度就你能調(diào)諾到所需求的波長,。如果用平面鏡代替色散棱鏡，激光器的輸出功率夠到散熱速度的限制,，又由于腔內(nèi)放電功率很大,，約為5000w/cm3，相應(yīng)的溫度為3000—5000度K,，所以放電管要通循環(huán)以加強冷卻,，并用導熱率高的氧化鈹毛吸管以提高，輸出功率,，現(xiàn)代有些150mW或功率更低的,，可用強制風冷，壽命可達5000小時。

    氪離子激光器與氬離子激光器類似,，但譜線集中在可見光長波部分,，以647nm較強，但噪聲較大,。染料激光器是將有機染料溶液為另一激光器泵浦發(fā)出長波長的激光,，例如用氬離子激光器514nm激光泵譜含有Rhodamine  6G水溶液的染料激光器，則后者可輸出從550nm到650nm連續(xù)可變的激光,，在590nm處轉(zhuǎn)換效率可高達50%。免疫學上使用的一些染料,，其激光光波長在550nm以上,，這時就可用染料激光器。