間接ELISA法篩選陽(yáng)性雜交瘤及測(cè)定單抗清河常數(shù)

   酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法，簡(jiǎn)稱ELISA（enzyme-linkde innunosorbent assay）,，是把特異性的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)與酶促反應(yīng)相結(jié)合,，zui后以酶促反應(yīng)的放大作用來(lái)顯示zui初的免疫反應(yīng)，它既能用于抗原的測(cè)定又可用于抗體的測(cè)定,。間接ELISA法及時(shí)能測(cè)定抗體的一種ELISA方法,，現(xiàn)將可溶性抗原或細(xì)菌細(xì)胞包被于聚苯乙烯酶標(biāo)板上，然后加入待測(cè)抗體液,，在加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗鼠抗體,，zui后加入HRP底物,，依據(jù)顯色反應(yīng)的程度來(lái)判斷抗體的有無(wú)及活性的高低。間接ELISA具有敏感性高,，可檢測(cè)抗體濃度在ug-ng/ml水平,，重復(fù)性好，快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),，是篩選陽(yáng)性雜交瘤及測(cè)定單抗親和常數(shù)的常用方法,。

材料與方法

間接ELISA篩選陽(yáng)性雜交瘤

1、抗原包被 如是可溶性抗原,、根據(jù)其面議原性用碳酸鹽緩沖液（0.01mol/L Na2CO30.01mol/L NaHCO3,， PH9.6)溶解成0.1-20ug/ml，然后以每孔0.1ml加入96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板中,，4℃guo夜,。

如是細(xì)胞抗原，則將對(duì)生長(zhǎng)期每孔含10個(gè)細(xì)胞加入酶標(biāo)板,，37℃ 5% CO2孵箱培養(yǎng)24-48小時(shí),，令細(xì)胞場(chǎng)面貼壁后，棄培養(yǎng)液,，已含0.05%Tween-20的PBST液洗1次,，加入0.05%戊二醇0.1ml，4℃置5分鐘,，然后以PBST洗3次,，每次3分鐘。

2 封閉 PBST洗包被板1次,，每孔加0.1ml0.1%牛許晴血蛋白液（溶于PBS）,，4℃guo夜已封閉非特異性位點(diǎn)。

3 一抗溫育 將封閉好的酶標(biāo)板以PBST洗1次,，無(wú)菌下取融合細(xì)菌孔發(fā)黃的待測(cè)培養(yǎng)液加入酶標(biāo)板,，每孔0.1ml，一個(gè)待測(cè)樣品設(shè)兩個(gè)檢測(cè)孔,。用無(wú)菌細(xì)胞生長(zhǎng)孔培養(yǎng)液做陰性對(duì)照,，如有陽(yáng)性抗體對(duì)照也應(yīng)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照。37℃溫育1小時(shí),。

4 酶標(biāo)二抗溫育 棄去待測(cè)上清,，PBST洗3次，每次3分鐘,。加入用PBS液稀釋成使用濃度的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠Ig抗體,，37℃溫育1小時(shí)。

5 洗滌 棄去酶標(biāo)二抗,，PBST洗6次,，每次3分鐘,。大鼠ELISA試劑盒

6 顯色反應(yīng) 避光下，先用現(xiàn)配鄰苯二胺（OPD）底物反應(yīng)液,，40mgOPD榮譽(yù)100mlPH5.0檸檬酸緩沖液中（含檸檬酸·H2O 2.10g,Na2HPO4·12H2O 7.61g）,，并加入30%H2O2150ul，然后每孔0.1ml加入酶標(biāo)板,，觀察顯色反應(yīng)狀況,，一般10分鐘左右即可每孔加入2mol/LH2SO4 0.1ml 以終止顯色反應(yīng)。

7 結(jié)果判定 在酶標(biāo)測(cè)定儀上一掃描波長(zhǎng)492nm測(cè)量各孔吸光值,，以待測(cè)孔吸光值高于陰性對(duì)照空0.5（可溶性抗原）或0.2（細(xì)胞抗原）為陽(yáng)性結(jié)果,。

間接ELISA法測(cè)定單抗親和常數(shù)

1 實(shí)驗(yàn)操作流程基本上上訴實(shí)驗(yàn)相似。

2 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn),，選擇3個(gè)城北比稀釋的抗原濃度包被96孔酶標(biāo)板,，如可溶線抗原可選擇1ug/孔，0.5ug/孔,，0.25ug/孔包被,，細(xì)胞抗原可選擇2x，1x,，0.5x,。

3 大策純化抗體的起始濃度為1mg/ml左右，以1:50,1:100,，1:400,1:800,1:1600,1：:3200,1:6400,1:12800稀釋度加入酶標(biāo)板,，且每個(gè)稀釋度至少應(yīng)設(shè)置2個(gè)測(cè)定空。

4 根據(jù)酶標(biāo)儀測(cè)定結(jié)果,，扣除陰性對(duì)照值,，然后以吸光值縱坐標(biāo)，以抗體稀釋度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)作劑量反應(yīng)曲線,，計(jì)算每個(gè)抗原包被濃度下zui大吸光值一半時(shí)對(duì)所對(duì)應(yīng)的抗體濃度,。即抗體的相對(duì)親和力

5 根據(jù)公式計(jì)算前和常熟Ka Ka=(n-1）/2（nAb-Ab)。其中Ab,Ab分別為包被抗原濃度為Ag,Ag時(shí),，zui大吸光值一半時(shí)所對(duì)應(yīng)的抗體濃度,。N=Ag/Ag,n一般取2即可，zui后常數(shù)表示Ka=X±1.96SE.

注意事項(xiàng)

1間接ELISA篩選陽(yáng)性孔融合細(xì)胞,，陽(yáng)性結(jié)果應(yīng)至少重復(fù)兩次才比較可靠,，否則容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。

2 測(cè)定親和常數(shù)時(shí),，抗原的包被濃度要選擇適當(dāng),，每步要充分封閉,，充分溫育,，充分洗滌,，以防記過(guò)出現(xiàn)偏差。

3 間接ELISA法一定要設(shè)置陰性對(duì)照,，如有陽(yáng)性對(duì)照,，也應(yīng)設(shè)置，以供參考,。