淺談酶聯(lián)免疫的基本原理及操作

酶聯(lián)免疫法基本原理：

　　1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay,，ELISA）用于IgG定量測定的文章，使得1966年開始用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展成液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的測定方法,。這一方法的基本原理是：①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面,，并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體,，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性,，又保留酶的活性。在測定時(shí),，把受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng),。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，zui后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例,。加入酶反應(yīng)的底物后,，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺刊物定性或定量分析,。由于酶的催化頻率很高,，故可極大地地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達(dá)到很高的敏感度,。 　

方法類型和操作步驟

　　ELISA可用于測定抗原,，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體,，②酶標(biāo)記的抗原或抗體,，③酶作用的底物。根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀以及檢測的具備條件,，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測方法。 　

?。ㄒ唬╇p抗體夾心法(Elisa試劑盒,進(jìn)口分裝試劑盒,進(jìn)口分裝試劑,標(biāo)準(zhǔn)品,）

　　雙抗體夾心法是檢測抗原zui常用的方法,，操作步驟如下：

　　（1）將特異性抗體與固相載體連接,，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì),。

　　（2）加受檢標(biāo)本：使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間,，讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合,，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì),。

　?。?）加酶標(biāo)抗體：使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體,。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān),。

　　（4）加底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物,。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量,。

　　根據(jù)同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物,，即可用雙抗原夾心法測定標(biāo)本中的抗體,。

　　（二）雙位點(diǎn)一步法

　　在雙抗體夾心法測定抗原時(shí),，如應(yīng)用針對抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇的單抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體,，則在測定時(shí)可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作一步（圖15-5）。這種雙位點(diǎn)一步不但簡化了操作,，縮短了反應(yīng)時(shí)間,，如應(yīng)用高親和力的單抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高,。單抗體的應(yīng)用使測定抗原的ELISA提高到新水平,。

　　在一步法測定中,，應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)（hookeffect），類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象,。當(dāng)標(biāo)本中待測抗原濃度相當(dāng)高時(shí),，過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成夾心復(fù)合物,，所得結(jié)果將低于實(shí)際含量,。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

　?。ㄈ╅g接法測抗體

　　間接法是檢測抗體zui常用的方法,，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法,。操作步驟如下：

　?。?）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì),。

　?。?）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物,。經(jīng)洗滌后,，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合,，在洗滌過程中被洗去,。

　　（3）加酶標(biāo)抗抗體：與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合,，從而使該抗體間接地標(biāo)記上酶,。洗滌后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量,。例如欲測人對某種疾病的抗體,，可用酶標(biāo)羊抗人IgG抗體。

　?。?）加底物顯色：顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體的量,。

　　本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標(biāo)抗抗體檢測各種與抗原相應(yīng)的抗體,。 

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　　競爭法可用于測定抗原，也可用于測定抗體,。以測定抗原為例,，受檢抗原和酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：

　?。?）將特異抗體與固相載體連接,，形成固相抗體。洗滌,。(Elisa試劑盒,進(jìn)口分裝試劑盒,進(jìn)口分裝試劑,標(biāo)準(zhǔn)品,）

　?。?）待測管中加受檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應(yīng),。如受檢標(biāo)本中無抗原,，則酶標(biāo)抗原能順利地與固相抗體結(jié)合。如受檢標(biāo)本中含有抗原,，則與酶標(biāo)抗原以同樣的機(jī)會與固相抗體結(jié)合,，競爭性地占去了酶標(biāo)抗原與固相載體結(jié)合的機(jī)會，使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少,。參考管中只加酶標(biāo)抗原,，保溫后，酶標(biāo)抗原與固相抗體的結(jié)合可達(dá)zui充分的量,。洗滌。 　?。?）加底物顯色：參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原zui多,，故顏色zui深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差,，代表受檢標(biāo)本抗原的量,。待測管顏色越淡，表示標(biāo)本中抗原含量越多,。

　?。ㄎ澹┎东@法測IgM抗體

　　血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時(shí)存在，后者會干擾IgM抗體的測定,。因此測定IgM抗本多用捕獲法,，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再測定特異性IgM,。操作步驟如下：

　?。?）將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM,。洗滌,。

　　（2）加入稀釋的血清標(biāo)本：保溫反應(yīng)后血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲,。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分,。

　　（3）加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結(jié)合。洗滌,。

　?。?）加入針對特異性的酶標(biāo)抗體：使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合。洗滌,。

　?。?）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標(biāo)本中的特異性IgM抗體存在,，是為陽性反應(yīng),。

　　（六）應(yīng)用親和素和生物素的ELISA

　　親和素是一種糖蛋白,，可由蛋清中提取,。分子量60kD，每個(gè)分子由4個(gè)亞基組成,，可以和4個(gè)生物素分子親密結(jié)合?，F(xiàn)在使用更多的是從鏈霉菌中提取的鏈霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又稱維生素H,，分子量244.31,，存在于蛋黃中。用化學(xué)方法制成的衍生物,，生物素－羥基琥珀亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide,，BNHS）可與蛋白質(zhì)、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物,。親和素與生物素的結(jié)合,，雖不屬免疫反應(yīng)，但特異性強(qiáng),，親和力大,，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。由于1個(gè)親和素分子有4個(gè)生物素分子的結(jié)合位置,，可以連接更多的生物素化的分子,，形成一種類似晶格的復(fù)合體。因此把親和素和生物素與ELIS偶聯(lián)起來,，就可大提高ELISA的敏感度,。

　　親和素－生物素系統(tǒng)在ELISA中的應(yīng)用有多種形式，可用于間接包被,，亦可用于終反應(yīng)放大,。可以在固相上先預(yù)包被親和素,，原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結(jié)合,，通過親和素－生物素反應(yīng)而使生物素化的抗體或抗在相化,。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結(jié)合點(diǎn)充分暴露,。另外,，在常規(guī)ELISA中的酶標(biāo)抗體也可用生物素化的抗體替代，然后連接親和素－酶結(jié)合物,，以放大反應(yīng)信號,。

ELISA 普遍用作非放射性同位素的成鍵化驗(yàn). 在這種方法中, 通常標(biāo)準(zhǔn)配體是固定的, 通過加入溶液相受體或蛋白質(zhì)來使之成鍵. 通過加入與受體特異性反應(yīng)的抗體來定量成鍵的受體, 而且zui初抗體的量以加入第二種能顯色的抗體測量. 第二種抗體能識別抗體的末端, 在其末端的堿性磷酸酯或過氧化物酶等與酶發(fā)生反應(yīng), 從而使溶液顯色. 

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