考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

一、目的

學(xué)習(xí)和掌握考馬斯亮藍(lán)G-250測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和方法,。

二,、原理

    考馬斯亮藍(lán)G-250（Coomassie brilliant blue G-250）法測(cè)定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法。考馬斯亮藍(lán)G-250在游離狀態(tài)下呈紅色,，zui大光吸收在465nm；當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，該結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下有zui大光吸收,。在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)（0～1000ug/mL），其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比,，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定,。蛋白質(zhì)于考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合在2min左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速,；其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定,。該法是1976年由Bradford建立的，試劑配制簡(jiǎn)單,，操作簡(jiǎn)便快捷,，反應(yīng)非常靈敏，可測(cè)定微克級(jí)蛋白質(zhì)的含量,，是一種常用的對(duì)微量蛋白質(zhì)進(jìn)行快速測(cè)定的方法,。

三、實(shí)驗(yàn)用品

1. 實(shí)驗(yàn)材料：新鮮綠豆芽,。
2. 器皿：

（1）,、分析天平、臺(tái)式天平,。

（2）,、分光光度計(jì)。

（3）,、離心機(jī),。

（4）、研缽1套,。

（5）,、離心管：10mL×1。

（6）,、刻度試管：10mL×1或量筒：10mL×1。

（7）,、移液管：5mL×1 , 2mL×1,，1mL×2，0.1mL× 3.

（8）,、試管：10mL× 14,，試管架，洗耳球。

3,、試劑

（1）,、牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸餾水中,，即為1000ug/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液,。

(2)、考馬斯亮藍(lán)G-250：稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G-250,，溶于50mL95%的乙醇中,，加入85%（m/V）的磷酸100mL，zui后用蒸餾水定容到1000mL,。此溶液在常溫下可放置一個(gè)月,。

四、操作步驟

1,、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

（1）,、0～100ug/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作；取6支10mL的試管加入試劑,，配制不同濃度的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液,。

另取6支15mL的試管，從上述各試管中分別吸取0.1mL溶液,，加入5mL考馬斯亮藍(lán)G-250,，充分混勻，放置2min后用1cm光徑的比色杯在595nm波長(zhǎng)下比色,，記錄各試管測(cè)定的光密度值并作標(biāo)準(zhǔn)曲線,。

（2）、0～1000ug/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取6支10mL的試管,，加入試劑,。

其余步驟同操作步驟1，作出蛋白質(zhì)濃度為0～1000ug/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線,。

2,、樣品提取液中蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定

（1）、待測(cè)樣品制備

稱取新鮮綠豆芽下胚軸2g放入研缽中,，加2mL蒸餾水研磨成勻漿,，轉(zhuǎn)移到離心管中，再用6mL蒸餾水分次洗滌研缽,，洗滌液收集于同一離心管中,，放置0.5～1b以充分提取，然后在4000r/min離心20min,，棄去沉淀,，上清液轉(zhuǎn)入10mL的刻度試管,，并以蒸餾水定容至刻度，即得待測(cè)樣品提取液,。

（2）,、測(cè)定

另取2支10mL的試管，分別吸取樣品提取液0.1mL（至少重復(fù)一次）,，加入5mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑,，充分混合，放置2min后用1cm光徑的比色杯在595nm下比色,，記錄各管測(cè)定的光密度值，并通過過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得待測(cè)樣品提取液中蛋白質(zhì)的含量X（ug）,。以標(biāo)準(zhǔn)曲線1號(hào)試管做空白,。

五、附注

1. 考馬斯亮藍(lán)G-250法由于染色方法簡(jiǎn)單迅速,，干擾物質(zhì)少,，靈敏度高，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定,。
2. 有些陽離子和有機(jī)溶劑存在時(shí)不干擾測(cè)定,，但大量的去污劑存在時(shí)會(huì)嚴(yán)重干擾測(cè)定。
3. 蛋白質(zhì)于考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合的反應(yīng)十分迅速,，反應(yīng)在2min左右達(dá)到平衡,，其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。因此測(cè)定時(shí),，不可放置太長(zhǎng)時(shí)間,，否則將使測(cè)定結(jié)果偏低。