蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot ）

實(shí)驗(yàn)方法原理：

Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上,，然后利用抗體進(jìn)行檢測的方法,。對已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測,，對新基因的表達(dá)產(chǎn)物,，可通過融合部分的抗體檢測。

與Southern或Northern雜交方法類似,，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳,，被檢測物是蛋白質(zhì),，“探針"是抗體，“顯色"用標(biāo)記的二抗,。

經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品,，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì),，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變,。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng),，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng),，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá),。

實(shí)驗(yàn)材料：蛋白質(zhì)樣品  

試劑：試劑盒 丙烯酰胺 SDS  Tris-HCl β-巰基乙醇 ddH2O 甘氨酸 Tris 甲醇 PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考馬斯亮蘭 乙酸 脫脂奶粉 硫酸鎳胺 H2O2 DAB試劑盒—（青島捷世康生物科技有限公司提供）。

儀器:耗材 電泳儀 電泳槽 離心機(jī) 離心管 硝酸纖維素膜 勻漿器 剪刀 移液槍 刮棒  

實(shí)驗(yàn)步驟：

一,、試劑準(zhǔn)備 

1.  SDS-PAGE試劑：見聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn),。

2.  勻漿緩沖液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml,；β-巰基乙醇 0.2 ml,；ddH2O 2.8 ml。

3.  轉(zhuǎn)膜緩沖液：甘氨酸 2.9 g,；Tris 5.8 g,；SDS 0.37 g；甲醇200 ml,；加ddH2O定容至1000 ml,。

4.  0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g,；Na2HPO4 1.44 g,；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml,。

5.  膜染色液：考馬斯亮蘭 0.2 g,；甲醇80 ml；乙酸2 ml,；ddH2O118 ml,。包被液（5%脫脂奶粉，現(xiàn)配）：脫脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中,。

6.  顯色液：DAB 6.0 mg,；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸鎳胺 0.1 ml,；H202 1.0 μl,。

二,、蛋白樣品制備：

1. 單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提取

（1）倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫菏箽堄嗯囵B(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）,。

（2）每瓶細(xì)胞加3 ml 4℃預(yù)冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）,。平放輕輕搖動1 min洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液,。重復(fù)以上操作兩次,，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上,。

（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM）,，搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結(jié)晶時才可與裂解液混合,。）

（4） 每瓶細(xì)胞加400 μl含PMSF的裂解液,，于冰上裂解30 min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動,。

（5）裂解完后,，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片

和裂解液移至1.5 ml離心管中,。（整個操作盡量在冰上進(jìn)行,。）

（6）于4℃下12000 rpm離心5 min。（提前開離心機(jī)預(yù)冷）

（7） 將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5 ml的離心管中放于－20℃保存,。

2. 組織中總蛋白的提取

（1）將少量組織塊置于1～2 ml勻漿器中球狀部位,，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。

（2） 加400 μL單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中,，進(jìn)行勻漿,。然后置于冰上。

（3）幾分鐘后再碾一會兒再置于冰上,，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎,。

（4） 裂解30 min后，即可用移液器將裂解液移至1.5 ml離心管中,，然后在4℃下12000 rpm離心5 min,，取上清分裝于0.5 ml離心管中并置于－20℃保存。

3.   加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提取

由于受藥物的影響,，一些細(xì)胞脫落下來,，所以除按1操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。以下是培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提?。?/SPAN>

（1）將培養(yǎng)液倒至15 ml離心管中,，于2500 rpm離心5 min。

（2）棄上清,，加入4 ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌,，然后2500 rpm離心5 min,。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次。

（3）用槍洗干上清后,，加100 μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30 min,，裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。

（4）將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4℃,、12000 rpm離心5 min,，取上清分裝于0.5 ml離心管中并置于－20℃保存。

三,、蛋白含量的測定

1.  制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

（1）從－20℃取出1 mg/ml BSA,，室溫融化后，備用,。

（2）取18個1.5 ml離心管,，3個一組，分別標(biāo)記為0 mg,，2.5 mg,，5.0 mg，10.0 mg,，20.0 mg，40.0 mg,。

（3）按下表在各管中加入各種試劑,。

（4） 混勻后，室溫放置2 min,。在生物分光光度計（Bio-Photometer,，Eppendorf）上比色分析。

2.  檢測樣品蛋白含量

（1）取足量的1.5 ml離心管,，每管加入4℃儲存的考馬斯亮藍(lán)溶液1 ml,。室溫放置30 min后即可用于測蛋白。

（2） 取一管考馬斯亮藍(lán)加0.15 mol/L NaCl溶液100 ml,，混勻放置2分鐘可做為空白樣品,，將空白倒入比色杯中在做好標(biāo)準(zhǔn)曲線的程序下按blank測空白樣品。

（3）棄空白樣品,，用無水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5 mL）,，再用無菌水洗一次。

（4）取一管考馬斯亮藍(lán)加95 ml 0.15 mol/L NaCl NaCl溶液和5 ml待測蛋白樣品,，混勻后靜置2 min,，倒入扣干的比色杯中按sample鍵測樣品。

注意：每測一個樣品都要將比色杯用無水乙醇洗2次,，無菌水洗一次,?？赏瑫r混合好多個樣品再一起測，這樣對測定大量的蛋白樣品可節(jié)省很多時間,。測得的結(jié)果是5 ml樣品含的蛋白量,。

四、SDS－PAGE電泳

1. 清洗玻璃板

一只手扣緊玻璃板,，另一只手蘸點(diǎn)洗衣粉輕輕擦洗,。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干,。

2. 灌膠與上樣

（1）玻璃板對齊后放入夾中卡緊,。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。（操作時要使兩玻璃對齊,，以免漏膠,。）

（2）按前面方法配10%分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠,。灌膠時,，可用10 ml槍吸取5 ml膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時即可,。然后膠上加一層水,，液封后的膠凝的更快。（灌膠時開始可快一些,，膠面快到所需高度時要放慢速度,。操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡,。加水液封時要很慢,，否則膠會被沖變型。）

（3）當(dāng)水和膠之間有一條折射線時,，說明膠已凝了,。再等3 min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。

（4）按前面方法配4%的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠,。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中,。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時要使梳子保持水平,。由于膠凝固時體積會收縮減小,，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠,。待到濃縮膠凝固后,，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。

（5）用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中,。（小玻璃板面向內(nèi),，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠,，那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外,。）

（6）測完蛋白含量后，計算含50 ng蛋白的溶液體積即為上樣量,。取出上樣樣品至0.5 ml離心管中,，加入5×SDS 上樣緩沖液至終濃度為1×。（上樣總體積一般不超過15 μl,，加樣孔的zui大限度可加20 μl樣品,。）上樣前要將樣品于沸水中煮5 min使蛋白變性。

（7）加足夠的電泳液后開始準(zhǔn)備上樣,。（電泳液至少要漫過內(nèi)測的小玻璃板,。）用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡,。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品,。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出,。加入下一個樣品時,，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染,。

3.   電泳

電泳時間一般4～5 h,，電壓為40 V較好，也可用60 V,。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳,，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,。

五,、轉(zhuǎn)膜 

1. 轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備6張7.0～8.3 cm的濾紙和1張7.3～8.6 cm的硝酸纖維素膜。切濾紙和膜時一定要戴手套,，因?yàn)槭稚系牡鞍讜廴灸?。將切好的硝酸纖維素膜置于水上浸2 h才可使用。（用鑷子捏住膜的一邊輕輕置于有超純水的平皿里,，要使膜浮于水上,，只有下層才與水接觸。這樣由于毛細(xì)管作用可使整個膜浸濕,。若膜沉入水里,，膜與水之間形成一層空氣膜，這樣會阻止膜吸水。

2. 在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子,、兩塊海綿墊,、一支玻棒、濾紙和浸過的膜,。

3. 將夾子打開使黑的一面保持水平,。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡,。（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動,。）在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊于墊子上），一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡,。

4. 要先將玻璃板撬掉才可剝膠,，撬的時候動作要輕，要在兩個邊上輕輕的反復(fù)撬,。撬一會兒玻璃板便開始松動,，直到撬去玻板。（撬時一定要小心,，玻板很易裂,。）除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作）,，要避免把分離膠刮破,。小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對齊,，輕輕用玻棒搟去氣泡,。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個膠（膜蓋下后不可再移動）并除氣泡,。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡,。zui后蓋上另一個海綿墊，搟幾下就可合起夾子,。整個操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行,，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸,，

接觸后會發(fā)生短路,。（轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時要戴手套,，實(shí)驗(yàn)室要開門以使空氣流通,。）

5. 將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面,，夾的白面對槽的紅面,。電轉(zhuǎn)移時會產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。一般用60 V轉(zhuǎn)移2 h或40 V轉(zhuǎn)移3 h,。

6. 轉(zhuǎn)完后將膜用1×麗春紅染液染5 min（于脫色搖床上搖）,。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。將膜晾干備用,。

六,、免疫反應(yīng)

1 .將膜用TBS從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中,，室溫下脫色搖床上搖動封閉1h,。

2. 將一抗用TBST稀釋至適當(dāng)濃度（在1.5 ml離心管中）；撕下適當(dāng)大小的一塊兒保鮮膜鋪于實(shí)驗(yàn)臺面上,，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整,；將抗體溶液加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜,，用濾紙吸去殘留液后,，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動膜四角以趕出殘留氣泡,；室溫下孵育1～2 h后,，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10 min,；再用TBS洗一次,，10 min。

3. 同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸,，室溫下孵育1～2 h后,，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10 min,；再用TBS洗一次,，10 min，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng),。

七,、化學(xué)發(fā)光，顯影,，定影

1. 將A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合,；1 min后,，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸,；1 min后，將膜移至另一保鮮膜上,，去盡殘液,，包好，放入X-光片夾中。

2. 在暗室中,，將1×顯影液和定影液分別到入塑料盤中,；在紅燈下取出X－光片，用切紙刀剪裁適當(dāng)大?。ū饶さ拈L和寬均需大1 cm）,；打開X-光片夾，把X－光片放在膜上,，一旦放上,，便不能移動，關(guān)上X-光片夾,，開始計時,；根據(jù)信號的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時間，一般為1 min或5 min,，也可選擇不同時間多次壓片,，以達(dá)*效果；曝光完成后,，打開X-光片夾,，取出X-光片，迅速浸入顯影液中顯影,，待出現(xiàn)明顯條帶后,，即刻終止顯影。顯影時間一般為1～2 min（20～25℃）,，溫度過低時（低于16℃）需適當(dāng)延長顯影時間,；顯影結(jié)束后，馬上把X-光片浸入定影液中,，定影時間一般為5～10 min,，以膠片透明為止；用自來水沖去殘留的定影液后,，室溫下晾干,。

應(yīng)注意的是：顯影和定影需移動膠片時，盡量拿膠片一角,，手指甲不要劃傷膠片,，否則會對結(jié)果產(chǎn)生影響。

八,、凝膠圖象分析

將膠片進(jìn)行掃描或拍照,，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。收起 

注意事項(xiàng) 

1. 一抗,、二抗的稀釋度,、作用時間和溫度對不同的蛋白要經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定*條件,。

2. 顯色液必須新鮮配置使用，zui后加入H2O2,。

3. DAB有致癌的潛在可能,，操作時要小心仔細(xì)。

展開   

其他 一,、免疫反應(yīng) 

1. 用0.01 M PBS洗膜,，5 min ×3次。

2. 加入包被液,，平穩(wěn)搖動,，室溫2 h

3. 棄包被液，用0.01 M PBS洗膜,，5 min×3次,。

4. 加入一抗（按合適稀釋比例用0.01 M PBS稀釋，液體必須覆蓋膜的全部）,，4℃ 放置12 h以上,。陰性對照，以1%BSA取代一抗,，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同,。

5. 棄一抗和1%BSA，用0.01 M PBS分別洗膜,，5 min×4次,。

6. 加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（按合適稀釋比例用0.01 M  PBS稀釋），平穩(wěn)搖動,，室溫2 h,。

7. 棄二抗，用0.01 M PBS洗膜,，5 min×4次,。

8. 加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時放入雙蒸水中終止反應(yīng),。