主要用途

真菌/細(xì)胞β-半乳糖苷酶活性高質(zhì)敏感比色法定量檢測試劑是一種旨在使用化學(xué)和物理方法,，快速有效地裂解真菌細(xì)胞，通過高速離心,，獲得澄清細(xì)胞裂解懸液,，在β-半乳糖苷酶反應(yīng)體系里，以氯苯胺紅 -β-D- 吡喃半乳糖苷為棕黃色底物,，水解所產(chǎn)生的暗紅色的氯苯胺紅,，即采用比色法定量測定細(xì)胞裂解懸液制備樣品中的β-半乳糖苷酶活性，藉此建立一種簡單的定量評價報告基因的而經(jīng)典的技術(shù)方法,。該技術(shù)由大師級科學(xué)家精心研制、成功實驗證明的,。廣泛應(yīng)用于基因組學(xué),、蛋白質(zhì)組學(xué)和其它分子生物學(xué)研究。其適用于轉(zhuǎn)基因后的真菌/酵母活體細(xì)胞分析,。產(chǎn)品即到即用,，性能穩(wěn)定，參數(shù)優(yōu)化,，操作簡便,、比色敏感，堪稱國際上同類產(chǎn)品*佳,。

產(chǎn)品內(nèi)容

裂解液（Reagent A）      10毫升

強(qiáng)化液（Reagent B）     2毫升

活性液（Reagent C）   250微升

稀釋液（Reagent D）    10毫升

反應(yīng)液（Reagent E）     2毫升

終止液（Reagent F）    10毫升

產(chǎn)品說明書     1份

保存方式

保存裂解液（Reagent A）,、活性液（Reagent C）和反應(yīng)液（Reagent E）在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融,；其余的保存在4℃冰箱里,；反應(yīng)液（Reagent E）避免光照；有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于真菌/酵母細(xì)胞收集的容器

1.5毫升離心管：用于真菌/酵母細(xì)胞裂解操作或染色的容器

臺式離心機(jī)：用于沉淀真菌/酵母細(xì)胞

微型臺式離心機(jī)：用于真菌/酵母細(xì)胞裂解懸液澄清

比色皿或96孔板：用于染色后比色檢測的容器

恒溫水槽或培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育

計時器：用于反應(yīng)計時

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于測定反應(yīng)物的吸光值

實驗步驟

實驗開始前,，開啟分光光度儀預(yù)熱,，設(shè)置波長420nm；開啟恒溫水槽,，設(shè)置溫度為28℃,。同時從－20℃冰箱里取出裂解液（Reagent A）、活性液（Reagent C）和反應(yīng)液（Reagent E）置于冰槽里融化,；反應(yīng)液（Reagent E）避免光照,。然后進(jìn)行下列操作：

一,、 樣品準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好10毫升待測的新鮮真菌/酵母細(xì)胞（OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷細(xì)胞/毫升）

2． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管

3． 置于冰槽里5分鐘

4． 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心5分鐘,，速度為1000g

5． 小心抽去上清液

6． 加入250微升裂解液（Reagent A）,，充分混勻

7． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

8． 加入100微升強(qiáng)化液（Reagent B）

9． 加入12.5微升活性液（Reagent C）

10． 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒

11． 置于冰槽里1分鐘

12． 重復(fù)實驗步驟10至11五次

13． 加入250微升裂解液（Reagent A），充分混勻

14． 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心15分鐘,，速度為16000g（或13000RPM,，例如eppendorf 5415）

15． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

16． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 活性檢測

方法一：常規(guī)檢測（比色皿）

1． 移取100微升上述制備的細(xì)胞裂解懸液樣品到新的比色皿

2． 加入500微升稀釋液（Reagent D）

3． 上下傾倒數(shù)次,，混勻

4． 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育5分鐘

5． 加入100微升反應(yīng)液（Reagent E）（注意：使用前,，充分混勻反應(yīng)液（Reagent E）中可能的沉淀） 

6． 上下傾倒數(shù)次，混勻

7． 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育至少30分鐘,，直至出現(xiàn)暗紅色（注意：參見注意事項11和12）

8． 加入300微升終止液（Reagent F）

9． 即刻放入分光光度儀檢測,，記錄樣品吸光讀數(shù)，理想讀數(shù)為0.1至1.2范圍內(nèi)

一,、 計算樣品活性

計算一：按照操作步驟規(guī)定

1． 比色皿計算：

[樣品讀數(shù) X 1.0（反應(yīng)體積,，毫升）]÷[0.1（樣品容量，毫升）X 5.5（毫摩爾吸光系數(shù)）X 反應(yīng)時間（分鐘）]＝微摩爾CPRG/分鐘/毫升

2．96孔板計算：

  [樣品讀數(shù) X 0.25（反應(yīng)體積,，毫升）]÷[0.02（樣品容量,，毫升）X 5.5（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.5（厘米）X反應(yīng)時間（分鐘）]＝微摩爾CPRG/分鐘/毫升

計算二：基本公式

[樣品讀數(shù)X樣品稀釋倍數(shù) X反應(yīng)體積（毫升）]÷[樣品容量（毫升）X 5.5（毫摩爾吸光系數(shù)）X 比色距徑（厘米）X反應(yīng)時間（分鐘）]＝微摩爾CPRG/分鐘/毫升

計算三：（微摩爾CPRG/分鐘/毫升）換算成（微摩爾CPRG/分鐘/毫克樣品蛋白）

[實際活性值（微摩爾CPRG/分鐘/毫升）]÷實際樣品蛋白濃度（毫克/毫升）＝微摩爾CPRG/分鐘/毫克樣品蛋白

注意事項

1． 本產(chǎn)品為20次（比色皿）和80次（96孔板）操作

2． 建議使用核內(nèi)表達(dá)的載體代替胞內(nèi)表達(dá)的載體轉(zhuǎn)染或感染細(xì)胞

3． 本產(chǎn)品的各項參數(shù)達(dá)到化

4． 建議操作時，注意避光

5． 操作時,，須戴手套

6． 強(qiáng)化液（Reagent B）為固體狀,，移取方法為：使用1毫升槍頭，將部分剪去,；或使用0.5毫升PCR管的蓋子內(nèi)圈盛滿,；或秤重0.1克

7． 反應(yīng)液（Reagent E）避免光照和反復(fù)凍融

8． 用戶可以測定細(xì)胞裂解懸液的蛋白濃度，便于計算活性單位之需,；建議使用－Bradford蛋白質(zhì)濃度定量檢測試劑盒（GMS30030.1）

9． 如果用戶需要測定背景空對照,，可以按照活性檢測的操作步驟進(jìn)行，變化在于100微升樣品改成100微升裂解液（Reagent A）替代

10． 如果用戶測得背景空對照,，計算活性時,，勿忘（樣品吸光讀數(shù)－背景空對照讀數(shù)）

11． 反應(yīng)孵育時間的理想范圍為10分鐘至30分鐘內(nèi)出現(xiàn)暗紅色顯色：低于5分鐘表明酶活性過高，建議稀釋樣品,，否則影響檢測精度 

12． 如果樣品的酶活性過低,，可以增加孵育時間至72小時

13． 樣品的酶活性吸光值在0.1至1.2 OD單位為理想狀態(tài)，其酶活性與吸光值成線性正相關(guān),；吸光值在0.3至0.9 OD單位為狀態(tài)

14． 反應(yīng)終止后,，即刻進(jìn)行比色測定

15． 比色測定后，比色皿須清洗

16． 酶活性單位濃度定義：在37℃溫度下,，每單位酶在單位時間內(nèi)（每分鐘）水解1微摩爾的氯苯胺紅 -β-D- 吡喃半乳糖苷

17． 本公司提供系列β-半乳糖苷酶檢測試劑產(chǎn)品