主要用途

逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）活性PERT熒光(SYBR GREEN)定量PCR檢測(cè)試劑是一種旨在運(yùn)用SYBR綠色熒光染料作為標(biāo)記信號(hào),，結(jié)合產(chǎn)物增強(qiáng)型逆轉(zhuǎn)錄酶（PERT）的PCR擴(kuò)增,，既方便、快速,，又實(shí)時(shí)檢測(cè)和定量分析擴(kuò)增產(chǎn)物,，即逆轉(zhuǎn)錄酶酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制,、成功實(shí)驗(yàn)證明的,。廣泛應(yīng)用于臨床病毒感染、生物制品,，例如疫苗等病毒污染的監(jiān)測(cè),。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定,，無核酶污染,，操作便捷，敏感高效,，定量準(zhǔn)確,，重復(fù)性強(qiáng)。

保存方式

保存在－20℃冰箱里,，避免反復(fù)凍融,；染色液（Reagent F）避免光照，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

4℃微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

PCR管：用于樣品擴(kuò)增操作的容器

熒光定量PCR儀：用于熒光定量PCR反應(yīng)

實(shí)驗(yàn)提示

一,、 標(biāo)準(zhǔn)樣品制備

1． 準(zhǔn)備好7個(gè)無菌的1.5毫升離心管,，標(biāo)記為1至7號(hào)管

2． 按下表分別加入18微升的稀釋液（Reagent I）到2至7管

3． 移取5微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到1號(hào)管

4． 小心移取2微升1號(hào)管的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到2號(hào)管，混勻

5． 小心移取2微升2號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到3號(hào)管,，混勻

6． 小心移取2微升3號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到4號(hào)管,，混勻

7． 以此類推

8． 將1至7號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表

一,、 定量檢測(cè)

1． 移取2微升引導(dǎo)液（Reagent A）到0.5毫升PCR管

2． 加入2微升底物液（Reagent B）

3． 加入6微升補(bǔ)充液（Reagent C）

4． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)瞬時(shí)離心5秒

5． 在70℃溫度下孵育3分鐘

6． 冰上預(yù)冷

7． 加入13微升轉(zhuǎn)錄液（Reagent D）

8． 加入2微升上述制備的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）或待測(cè)樣品（注意：選擇4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品+空對(duì)照）

9． 總量25微升

10． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)瞬時(shí)離心5秒

11． 在42℃溫度下孵育30分鐘

12． 在95℃溫度下孵育5分鐘

13． 置于冰槽里備用

14． 移取15微升反應(yīng)液（Reagent E）到0.5毫升PCR管

15． 加入2微升上述冰槽里備用的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物

16． 加入2.5微升染色液（Reagent F）

17． 加入5.5微升補(bǔ)充液（Reagent D）到總量25微升

18． 使用1000微升槍頭加入1滴封隔液（Reagent G）（注意：參見注意事項(xiàng)10）

19． 即刻放進(jìn)熒光定量PCR儀

20． 熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)?/span>（選擇FAM染料）：

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為20次PCR反應(yīng)

2． 本產(chǎn)品檢測(cè)敏感度達(dá)10^-8單位/微升

3． 操作時(shí),，須戴手套

4． 本產(chǎn)品適合各種熒光定量PCR儀

5． 建議整個(gè)操作在4℃下進(jìn)行

6． 必須使用帶濾芯的槍頭

7． 所有器皿、離心管,、液體等無RNA酶污染

8． 使用時(shí),，避免污染母液

9． 用戶根據(jù)實(shí)際情況，選擇4至5管標(biāo)準(zhǔn)區(qū)間范圍

10． 根據(jù)用戶PCR儀的性能,，決定是否加入封隔液（Reagent G）

11． 配制完成后,，即刻進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，以確保反應(yīng)物的活性

12． 試劑避免反復(fù)凍融

13． PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初3個(gè)循環(huán)為定量基線,；3至15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的10倍值為熒光閾值,；熒光信號(hào)達(dá)到閾值所需的循環(huán)數(shù)為Ct值,；建議使用Log ΔRn相對(duì)定量參數(shù)（參考圖像如下）：

1． 通常10³至10⁴皮單位（pU）逆轉(zhuǎn)錄酶等于1至10個(gè)病毒粒子（virion）

2． 通常10³皮單位（pU）逆轉(zhuǎn)錄酶等于70至80逆轉(zhuǎn)錄酶分子

3． 本公司提供系列逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢測(cè)試劑產(chǎn)品