主要用途

細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄酶（REVERSE TRANSCRIPTASE）活性熒光定量檢測試劑是一種旨在通過雙鏈分子底物,，在dTTP的參與下,，通過逆轉(zhuǎn)錄酶的催化，聚合產(chǎn)生RNA-DNA異源雙鏈DNA分子,，由PicoGreen特異染色,，即采用熒光法來測定細(xì)胞裂解樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制,、成功實驗證明的,。其適用于各種細(xì)胞裂解懸液樣品（動物、人體,、昆蟲等）逆轉(zhuǎn)錄酶的活性,，以及抑制劑檢測,。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用,，操作簡捷,，性能穩(wěn)定。

保存方式

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里,；其余的保存在－20℃冰箱里,；染色液（Reagent F）避免光照；有效保證6月 

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于細(xì)胞脫離

DOUNCE勻漿器：用于裂解細(xì)胞

（微型）臺式離心機(jī)：用于樣品操作

200微升1厘米光徑比色皿或黑色96孔板：用于熒光分析的容器

熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于熒光分析

實驗步驟

實驗開始前,，將－20℃冰箱里的試劑盒中的裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化,。然后進(jìn)行下列操作。

一,、 樣品準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁷細(xì)胞）

2． 小心加入3毫升清理液（Reagent A）,，覆蓋生長表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用消化）

5． 加入3毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞

6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）

7． 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心5分鐘,，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入置于冰槽里的500微升裂解液（Reagent B） 

10． 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒,，充分混勻

11． 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器

12． 在冰槽里用勻漿棒勻化細(xì)胞（約80下）

13． 將所有細(xì)胞勻漿物移入1.5毫升離心管

14． 即刻放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g

15． 小心移取上清液到新的無菌的1.5毫升離心管

16． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

17． 放進(jìn)－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

二,、 測定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好待測樣品（例如細(xì)胞裂解萃取液或純化酶樣品等）,，置于冰槽里

2． 設(shè)定好熒光酶標(biāo)儀（溫度為25℃）：激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長520nm,；增益倍數(shù)50至100 

3． 準(zhǔn)備好5個1.5毫升離心管,，標(biāo)記為1至5號管

4． 分別加入10微升裂解液（Reagent B）到1至5號管

5． 移取10微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到1號管，混勻

6． 小心移取10微升1號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到2號管,，混勻

7． 小心移取10微升2號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到3號管，混勻

8． 小心移取10微升3號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到4號管,，混勻

9． 將1至5號管放進(jìn)冰槽里備用,；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表

注意事項

1． 本產(chǎn)品為20次操作

2． 操作時，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過程中,，標(biāo)準(zhǔn)曲線測定只需1次

4． 樣品須澄清,，至關(guān)重要

5． 每個樣品需要進(jìn)行平行測試：失活樣品和待測樣品，以排除樣品DNA本底

6． 失活樣品：將待測樣品置于70至90度水浴鍋孵育10分鐘,，然后置于冰槽里冷卻

7． 樣品中避免使用EDTA,、EGTA、NaCl,、MgCl2,、Triton X-100等

8． 反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行熒光測定

9． 測定值由低到高變化

10． 樣本測定樣品讀數(shù)高于背景讀數(shù)表明具有酶活性

11． 待測樣本為粗提酶樣品，其蛋白濃度為10微克/5微升,；待測樣本為細(xì)胞裂解懸液,，其蛋白濃度為50微克/5微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）

12． 如果待測樣品濃度過高或過低,，可以調(diào)整樣品濃度

13． 逆轉(zhuǎn)錄酶單位活性定義為：在25℃，pH 8.1條件下,，每小時內(nèi)能夠轉(zhuǎn)錄1納克DNA所需的酶量作為一個活性單位