可見分光光度法正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體50mL×1 瓶,，4℃保存,。

試劑一：粉劑×1 瓶,，-20℃保存,；臨用前每瓶加入5mL蒸餾水,，充分溶解備用,；用不完的試劑仍-20℃保存。

試劑二：液體15mL×1 瓶，4℃保存,。試劑三：液體50mL×1 瓶,，4℃保存,。

產(chǎn)品說明：

β-GAL(EC 3.2.1.23)廣泛存在于動物,、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,，能夠催化β半乳糖苷化合物中β半乳糖苷鍵水解，此外還具有轉(zhuǎn)半乳糖苷的作用。β-GAL不僅可為植物的快速生長釋放儲存的能量，還能在正常的多糖代謝,、細(xì)胞壁組分代謝以及衰老時細(xì)胞壁降解過程中催化多糖,、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖殘基的水解,，釋放自由的半乳糖,。

β-GAL分解對-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成對-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰,，通過測定吸光值升高速率來計算β-GAL 活性,。

自備用品：

可見分光光度計、臺式離心機(jī),、水浴鍋,、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水,。

操作步驟：

一,、粗酶液提?。?/span>

1、 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為500~1000：1  的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴,，功率20％或200W，超聲3s,，間隔10s,，重復(fù)30次）,；15000g 4℃離心10min，取上清,，置冰上待測,。

2,、 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿,。15000g 4℃離心10min,，取上清，置冰上待測,。

二,、測定步驟：

1、 分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至400nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2、 樣本測定（在 EP  管中依次加入下列試劑）：

充分混勻,，400nm 處測定吸光值 A，計算ΔA=A 測定-A 對照,。每個測定管需設(shè)一個對照管,。三、β-GAL 活性計算：

標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y = 0.32x -0.0027,；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL）,，y 為吸光值。

（1） 按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每小時產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位,。

β-GAL 活力(nmol/h /mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.32×V 反總]÷(V 樣×Cpr)÷T

=62.5×(ΔA+0.0027)÷Cpr

需要另外測定,，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g 組織每小時產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位,。

β-GAL 活力(nmol/h /g 鮮重)＝[(ΔA+0.0027)÷0.32×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=62.5×(ΔA+0.0027) ÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每小時產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位,。

β-GAL 活力(nmol/h /10⁴ cell)=[(ΔA+0.0027) ÷0.32×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=0.125×(ΔA +0.0027)

Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；V 反總：反應(yīng)體系總體積,，0.5mL；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積,，0.05mL,；V 樣總：加入提取液體積，1mL,；W：樣本質(zhì)量,，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),，500 萬,；T：反應(yīng)時間，0.5h,。