微量法 100 管/48 樣

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

α-GC(EC 3.2.1.20)廣泛存在于動物,、植物,、微生物和培養(yǎng)細胞中，催化水解芳基或烴基與糖基之間的α-糖苷鍵生成葡萄糖,，不僅與細胞壁的松弛或加固有關,，而且與細胞識別和一些信號分子產(chǎn)生密切相關。

測定原理：

α-GC 分解對-硝基苯-α-D 吡喃葡萄糖苷生成對-硝基苯酚,，后者在 400nm 有最大吸收峰,， 通過測定吸光值升高速率來計算α-GC 活性。

自備用品：

可見分光光度計/酶標儀,、臺式離心機,、水浴鍋、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96 孔板,、研缽、冰和蒸餾水,。

試劑組成和配制：

提取液：液體 100mL×1 瓶,，4℃保存。

試劑一：粉劑×1 瓶,，-20℃保存,；臨用前加入 12mL 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存,。

試劑二：液體 15mL×1 瓶,，4℃保存。試劑三：液體 15mL×1 瓶,，4℃保存,。粗酶液提取：

1,、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量

（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液）,，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴,，功率 20％或 200W，超聲 3s,，間隔 10s,，重復 30 次）； 15000g 4℃離心 10min,，取上清,，置冰上待測。

2,、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織,，加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿,。15000g 4℃離心 10min,，取上清，置冰上待測,。

測定步驟

1,、 分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 400nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2、加樣表

充分混勻,，放入 37℃準確水浴 30min 后,，立即放入 95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）,，流水冷卻后充分混勻（以保證濃度不變）,，8000g，4℃,，離心 5min,，取上清液（在 EP 管或 96 孔板中加入下列試劑）

充分混勻,，室溫靜置 2min 后， 400nm 處測定吸光值 A,，計算 ΔA=A 測定管-A 對照管,。每個測定管需設一個對照管。

α-GC 活力計算：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準條件下測定的回歸方程為 y = 0.00585x -0.0027,；x 為標準品濃度（nmol/mL）,，y 為吸光

值。

（1） 按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位,。

α-GC 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V 反總]÷(V 樣×Cpr)÷T

=56.98×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位,。

α-GC 活性(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=56.98×(ΔA+0.0027) ÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。

α-GC 活性(nmol/min/10⁴cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=0.114×(ΔA +0.0027)

V 反總：反應體系總體積,，0.3mL,；V 樣：加入反應體系中樣本體積，0.03mL,；V 樣總：加入提取液體積,，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,； 500：細胞或細菌總數(shù),，500 萬；T：反應時間,，30min,。

b. 用 96 孔板測定的計算公式如下

標準條件下測定的回歸方程為 y =  0.0039x  -0.0027,；x 為標準品濃度（nmol/mL）,，y 為吸光

值。

（1） 按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位,。

α-GC 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V 反總]÷(V 樣×Cpr)÷T

=85.47×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位,。

α-GC 活性(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.0039×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=85.47×(ΔA+0.0027) ÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。

α-GC 活性(nmol/min/10⁴cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=0.171×(ΔA +0.0027)

V 反總：反應體系總體積,，0.3mL,；V 樣：加入反應體系中樣本體積，0.03mL,；V 樣總：加入提取液體積,，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g； 500：細胞或細菌總數(shù),，500 萬,；T：反應時間，30min,。