分光光度法 50 管/24 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

PPO（EC1.10.3.1）主要存在于動(dòng)物,、植物,、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是一種含銅的氧化酶,， 能使一元酚和二元酚氧化產(chǎn)生醌,，從而引起褐化，與果蔬加工,、茶葉品質(zhì)和組培等密切相關(guān),。  測(cè)定原理：

PPO 能夠催化鄰苯二酚產(chǎn)生醌,，后者在 525nm 有特征光吸收。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì),、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋,、可調(diào)式移液器,、1mL 玻璃比色皿、研缽,、冰和蒸餾水,。

試劑組成和配制：

提取液：液體，60mL×1 瓶,，4℃保存,； 試劑一：液體，40mL×1 瓶,，4℃保存,； 試劑二：液體，10mL×1 瓶,，4℃保存,； 粗酶液提取：

1,、細(xì)菌,、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清,；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量

（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液）,，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W,，超聲 3s,，間隔 10s，重復(fù) 30 次）,； 8000g 4℃離心 10min,，取上清，置冰上待測(cè),。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織,，加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿,。8000g 4℃離心 10min,，取上清，置冰上待測(cè),。

2,、血清（漿）或果汁樣本的處理：

按照血清（漿）或果汁體積（mL）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議取 0.1mL血清（漿）或果汁加入 1mL 提取液）,，進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,，取上清,，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1,、 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 525nm，蒸餾水調(diào)零,。

2,、 樣本測(cè)定（在 EP 管中依次加入下列試劑）

37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃（其它物種）中準(zhǔn)確水浴 10min 后，95℃水浴 5min

充分混勻,，10000g,，25℃離心 10min，取上清,，525nm 處檢測(cè)測(cè)定管和對(duì)照管吸光度,。ΔA=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管。

注意：煮沸樣本的操作：取 300μL 離心上清于 EP 管中,，進(jìn)行 5min 95℃水浴處理,；每個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管，可以在不同對(duì)照管中加入不同樣品的粗酶液,，然后集中進(jìn)行 5min

95℃水浴處理,。

PPO 活性計(jì)算：

1、血清（漿）或果汁 PPO 活性

單位的定義：每分鐘每 mL 血清（漿）或果汁在每 mL 反應(yīng)體系中使 525nm 處吸光值變化

0.01 為一個(gè)酶活力單位,。

PPO（U/mL）=ΔA×V 反總÷(V 液× V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =60×ΔA÷V 液

2,、組織、細(xì)菌或細(xì)胞 PPO 活性

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位定義：每分鐘每 mg 組織蛋白在每 mL 反應(yīng)體系中使 525nm 處吸光值變化 0.01 為一個(gè)酶活力單位,。

PPO（U/mg prot）=ΔA×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷0.01÷T =60×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度,。

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位定義：每分鐘每 g 組織在每 mL 反應(yīng)體系中使 525nm 處吸光值變化 0.01 為一個(gè)酶活力單位。

PPO（U/g 鮮重）=ΔA×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =60×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位定義：每分鐘每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每 mL 反應(yīng)體系中使 525nm 處吸光值變化 0.01 為一個(gè)酶活力單位,。

PPO（U/10⁴ cell）=ΔA×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =0.12×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積,，1.08mL；V 液：加入血清（漿）或果汁體積,，0.1mL,；V 樣：加入樣本體積，0.18mL,；V 樣總：加入提取液體積,，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間,，10 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g,；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn),。