可見分光光度法

注意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

NP在一定的溫度和中性 pH 條件下,，催化水解蛋白質(zhì),。由于其安全無毒、水解能力強,、作用范圍廣等特點,，中性蛋白酶常用于食品、飼料,、化妝品和營養(yǎng)保健品生產(chǎn)。

測定原理：

中性條件下,，NP催化酪蛋白水解產(chǎn)生酪氨酸,；在堿性條件下,，酪氨酸還原磷鉬酸化合物生成鎢藍；在680nm有特征吸收峰,。

自備儀器和用品：

可見分光光度計,、水浴鍋、磁力攪拌器,、可調(diào)式移液槍,、1mL玻璃比色皿、1.5 mLEP管和蒸餾水,。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1 瓶,，4℃保存。

試劑二：粉劑×1 瓶,，4℃保存,。臨用前加 10 mL 蒸餾水溶解。

試劑三：粉劑×1 瓶,，4℃避光保存,。臨用前加入 10 mL 試劑一，沸水溶解,。

試劑四：粉劑×1 瓶,， 4℃保存。臨用前加 50 mL 蒸餾水溶解,。

試劑五：液體×1 瓶,，4℃保存。

標準品：液體×1 支,，0.25 μ mol/mL 標準酪氨酸溶液,，4℃保存。

粗酶液提?。?/span>

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約0.1g組織,，

加入1mL試劑一）冰浴勻漿，8000g,，4℃離心 10min,，取上清，即粗酶液,。

2. 血清或培養(yǎng)液：直接測定,。

3. 細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500 萬細胞加入1mL試劑一）,，冰浴超聲波破碎細胞（功率300w,，超聲3秒，間隔7秒,，總時間3min）,；然后8000g,，4℃，離心10min,，取上清置于冰上待測,。

測定操作：

1.分光光度計預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長到680nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2.試劑二、試劑三和試劑四置于30℃水浴保溫 30min,。

3.對照管：取一支EP管,，加入100μL粗酶液，200μL試劑二,，混勻后置于30℃水浴保溫10min,；加入200μL試劑三，混勻后8000g,， 4℃離心10min,；取200μL上清液，加入新的EP管,，再加入 1000μL試劑四,，200μL試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min,，于680nm測定光吸收,，記為 A 對照管。

4.測定管：取一支EP管,，加入100μL粗酶液,，200μL試劑三，混勻后置于30℃水浴保溫10min,；加入200μL試劑二,，混勻后8000g， 4℃離心10min,；取200μL上清液,，加入新的EP管，再加入 1000μL試劑四,，200μL試劑五,，混勻后置于30℃水浴保溫20min，于680nm測定光吸收,，記為 A 測定管,。 （注意與空白管不同，先加試劑三,，后加試劑二）

5.空白管：取EP管,，加入200μL 蒸餾水,，1000μL試劑四,，200μL試劑五,，混勻后置于30℃水浴保溫20min，于680nm 測定光吸收,，記為A空白管,。

6.標準管：取EP管，加入200μL標準品,，1000μL試劑四,，200μL試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min,，于680nm 測定光吸收,，記為A標準管。

注意：空白管和標準管只需要測定一次,。

計算公式：

1. 按照樣本蛋白濃度計算

NP活性單位定義：30℃每毫克蛋白每分鐘水解產(chǎn)生1nmol 酪氨酸為1個酶活單位,。

NP活性（nmol/min /mg prot）= C標準品×（A測定管－A對照管）÷（A標準管－A空白管）

×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V1）÷T= 625×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）÷Cpr

C標準品：0.25μmol/mL 標準酪氨酸溶液；稀釋倍數(shù)：（100+200+200）÷200=2.5,；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）,，注意該粗酶液不能直接用于蛋白質(zhì)含量測定，需要另外測定,；建議稱取同樣質(zhì)量的樣品,，加入1mL蒸餾水勻漿提取離心后，用本公司蛋白質(zhì)含量測定試劑盒測定,；V1：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積（mL）,，100μL=0.1 mL；T：催化反應(yīng)時間（min）,，10min,。

2．按照樣本質(zhì)量計算

NP活性單位定義：30℃每克樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生 1 nmol 酪氨酸為 1 個酶活單位。

NP活性（nmol/min/g）=C標準品×（A測定管－A對照管）÷（A 標準管－A 空白管）×稀釋倍數(shù)÷（W×V1÷V2）÷T= 625×（A測定管－A對照管）÷（A標準管－A空白管）÷WC 標準品：0.25μmol/mL 標準酪氨酸溶液,；稀釋倍數(shù)：（100+200+200）÷200=2.5,；W：樣品質(zhì)量（g）；V1：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積（mL）,，100μL=0.1 mL,；V2：粗酶液總體積（mL），1mL,；T：催化反應(yīng)時間（min）,，10min。

3. 按照液體體積計算

NP活性單位定義：30℃每毫升樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmol 酪氨酸為1個酶活單位,。

NP活性（nmol/min/mL）=C 標準品×（A測定管－A對照管）÷（A標準管－A空白管）×稀釋倍數(shù)÷V1÷T= 625×（A測定管－A對照管）÷（A標準管－A空白管）

C 標準品：0.25 μ mol/mL 標準酪氨酸溶液,；稀釋倍數(shù)：（100+200+200）÷200=2.5,；V1：加入反應(yīng)體系中血清或培養(yǎng)液體積，100μL=0.1 mL,；T：催化反應(yīng)時間,，10min。

4. 按照細胞數(shù)量計算

NP活性單位定義：30℃每10⁴個細胞每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmo 酪氨酸為1個酶活單位,。

NP 活性（nmol/min /10⁴cell）=C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）×稀釋倍數(shù)÷（細胞數(shù)量×V1÷V2）÷T= 625×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）÷細胞數(shù)量

C 標準品：0.25 μ mol/mL 標準酪氨酸溶液,；稀釋倍數(shù)：（100+200+200）÷200=2.5； V1：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積,，100μL=0.1 mL,；V2：粗酶液總體積，1mL,；T：催化反應(yīng)時間,，

10min。

注意事項：

臨用前配制的試劑配制好后 4℃保存,，并且3天內(nèi)使用完畢,。