肉桂酸-4-羥基化酶(C4H)檢測試劑盒(肉桂酸比色法)產(chǎn)品簡介：

肉桂酸-4-羥基化酶是催化桂皮酸形成咖啡酸,、香豆酸的酶,，該酶多存在于高等植物,、酵母、菌類可溶性部分物質(zhì),，屬于細胞木質(zhì)素合成途徑中間的關鍵酶,，研究該酶可以探討多種生物細胞發(fā)育過程中木質(zhì)素沉積的代謝機理，為減少水果石細胞含量,、提高其品質(zhì)提供依據(jù),。

肉桂酸-4-羥基化酶(C4H)檢測試劑盒(肉桂酸比色法)檢測原理是以肉桂酸作為底物,，在酶促反應的適條件下采用每隔一定時間測定產(chǎn)物生成量的方法，于分光光度計或酶標儀290nm處檢測吸光度,，以吸光度變化所需酶量進行計算,。該試劑盒主要用于植物組織的裂解液或勻漿液、血清等樣品中內(nèi)源性的肉桂酸-4-羥基化酶活性,，尤其適用于檢測水果中肉桂酸-4-羥基化酶活性,，100T該試劑盒可以檢測47~48個樣品。該試劑盒僅用于科研領域,，不宜用于臨床診斷或其他用途,。

產(chǎn)品組成：

自備材料：

1、蒸餾水

2,、研缽或勻漿器

3,、離心管或試管

4、低溫離心機

5,、水浴鍋或恒溫箱

6,、比色杯或 96 孔板

7、分光光度計或酶標儀

操作步驟：

1,、準備樣品：

①植物樣品：取0.5g植物組織或水果中層果肉,，加入2ml C4H Lysis buffer，冰浴情況下充分搗碎研磨或勻漿,，4℃ 10000 r/min 離心15~20min,，留取上清液，-20℃凍存,，用于肉桂酸-4-羥基化酶的檢測,。

②血漿、血清和尿液樣品：血漿,、血清按照常規(guī)方法制備后可以直接用于本試劑盒的測定,，-20℃凍存，用于肉桂酸-4-羥基化酶的檢測,。

③細胞或組織樣品：取恰當細胞或組織裂解液,，如果有必要需進行適當勻漿，4℃ 10000g離心15~20min取上清液,，-20℃凍存,，用于肉桂酸-4-羥基化酶檢測。

④高活性樣品：如果樣品中含有較高活性的肉桂酸-4-羥基化酶,，可以使用蒸餾水或C4H Lysis buffer 稀釋進行恰當?shù)南♂尅?/span>

2,、配制NADPH 工作液：取1支 NADPH 加入1ml 蒸餾水，充分溶解，即為 NADPH 工作液,。該NADPH工作液 4℃保存1周,，-20℃保存2個月。

3,、C4H加樣：按照下表設置對照管,、測定管，溶液應按照順序依次加入,，并注意避免產(chǎn)生氣泡,。如果樣品中的C4H活性過高，可以減少樣品用量或適當稀釋后再進行測定,，樣品的檢測能設置2平行管,，求平均值。

4,、C4H 測定：以對照管為對照(調(diào)零),，比色杯光徑 1cm，立即以分光光度計測定290nm處測定管的吸光度(記為A測定 0),。37℃準確孵育1h,。立即加入 0.1ml C4H終止液終止反應，用C4H堿性基液調(diào)節(jié) pH 至約11(如用 pH 計檢測體積過小,，亦可考慮用pH試紙,，如無條件可省略該步驟)，以對照管為對照(調(diào)零),，比色杯光徑1cm,，立即以分光光度計測定290nm處測定管的吸光度(記為A測定1)。注意：加入C4H 終止液終止反應不是必須步驟,，可37℃準確孵育1h后直接以對照管為對照(調(diào)零),，比色杯光徑 1cm，立即以分光光度計測定 290nm 處測定管的吸光度(記為A測定1),。用酶標儀檢測,，體積可相應縮小，其余同分光光度計檢測操作,。

計算：

C4H活性單位的定義：在該實驗條件下,，每1h吸光度變化 0.01 所需酶量為一個活性單位。

組織樣品 C4H[U/(g•h) ]={(A測定1-A測定0)×VT}/(W×VS×0.01×t)

式中：A 測定1=孵育1h后測定管的吸光度

A測定0=加入C4H Assay buffer 后測定管的吸光度

W=組織樣品的重量(g)

VT=提取酶液的總體積(ml)

VS=測定時所用酶液體積(ml)

t=反應時間(h)=1

液體樣品 C4H[U/(ml•h) ]=(A 測定 1-A 測定 0)/( VS×0.01×t)

式中：A 測定 1=孵育1h 后測定管的吸光度

A測定0=加入C4H Assay buffer 后測定管的吸光度

VS=測定時所用酶液體積(ml)

t=反應時間(h)=1

注意事項：

1,、 待測樣品中不能含有酶抑制劑,，同時需避免反復凍融。

2,、 獲得上清液為C4H 酶液,，應盡快檢測,，亦可-20℃保存,。

3,、 加入C4H 終止液終止反應后，采用 C4H 堿性基液調(diào)節(jié) pH 至 11 左右,，以便檢測更為準確,，亦可考慮用 pH 試紙，如無條件可省略該步驟,。

4,、 C4H堿性基液具有一定腐蝕性，請小心操作,。

5,、 如果沒有分光光度計，也可以使用普通的酶標儀測定,，但本試劑盒不推薦用酶標儀檢測,，如需酶標儀檢測每次檢測指標不宜過多，否則操作時間不一,，有可能導致樣本間的差異,。

6、 為了您的安全和健康,，請穿實驗服并戴一次性手套操作,。

有效期：6 個月有效。