測定食品中蛋白質(zhì)的含量有很多種方法,，zui常見也zui普遍的就是凱氏定氮法。本文我們就主要通過介紹凱氏定氮法的整個操作流程,，來學(xué)習(xí)凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)的原理,，以及掌握凱氏定氮法的操作技術(shù),。包括樣品消化,、蒸餾,、滴定和蛋白質(zhì)含量的計算,。
    凱氏定氮法實驗原理：蛋白質(zhì)是含氮的化合物。食品與濃硫酸和催化劑共同加熱消化,，使蛋白質(zhì)分解，產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨,，留在消化液中,，然后加堿蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后,，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量來乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù),，即得蛋白質(zhì)含量,。因為食品中除蛋白質(zhì)外,，還含有其它含氮物質(zhì),，所以此蛋白質(zhì)稱為粗蛋白。粗蛋白也可直接用儀器測出,，如粗蛋白測定儀,，它有三種型號，分別為KDN-04A粗蛋白測定儀,，KDN-04B粗蛋白測定儀,，KDN-04C粗蛋白測定儀,。KDN系列凱氏定氮儀主要測定種子、糧食,、食品,、乳制品,、飲料,、飼料,、土壤及其他農(nóng)副產(chǎn)品中氮的含量。
凱氏定氮法儀器與試劑：
（一）試劑
硫酸銅（CuSO4?5H20）,、硫酸鉀,、硫酸（密度為1.8419g/L）、硼酸溶液（20g/L）,、氫氧化鈉溶液（400g/L）,、0.01mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液、混合指示試劑：0.1%甲基紅乙溶液液1份,，與0.1%溴甲酚綠乙醇溶液5份臨用時混合,、黃豆粉。
（二）儀器
微量定氮蒸餾裝置
凱氏定氮法實驗步驟
1,、樣品消化
稱取黃豆粉約0.3g（±0.001g）,，移入干燥的100mL凱氏燒瓶中，加入0.2g硫酸銅和6g硫酸鉀,，稍搖勻后瓶口放一小漏斗,，加入20mL濃硫酸，將瓶以450角斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上,，使用萬用電爐,，在通風(fēng)櫥中加熱消化，開始時用低溫加熱,，待內(nèi)容物全部炭化,，泡沫停止后，再升高溫度保持微沸,，消化至液體呈藍(lán)綠色澄清透明后,，繼續(xù)加熱0.5h，取下放冷,，小心加20mL水,，放冷后，無損地轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中,，加水定容至刻度,，混勻備用，即為消化液,。
試劑空白實驗：取與樣品消化相同的硫酸銅,、硫酸鉀、濃硫酸,，按以上同樣方法進(jìn)行消化,，冷卻，加水定容至100mL,，得試劑空白消化液,。
2,、定氮裝置的檢查與洗滌
檢查微量定氮裝置是否裝好。在蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)裝水約三分之二,，加甲基紅指示劑數(shù)滴及數(shù)毫升硫酸,，以保持水呈酸性，加入數(shù)粒玻璃珠（或沸石）以防止暴沸,。
測定前定氮裝置如下法洗滌2~3次：從樣品進(jìn)口入加水適量（約占反應(yīng)管三分之一體積）通入蒸汽煮沸,，產(chǎn)生的蒸汽沖洗冷凝管，數(shù)分鐘后關(guān)閉夾子a,，使反應(yīng)管中的廢液倒吸流到反應(yīng)室外層,，打開夾子b由橡皮管排出，如此數(shù)次,，即可使用,。
3、堿化蒸餾
量取硼酸試劑20mL于三角瓶中,，加入混合指示劑2~3滴,，并使冷凝管的下端插入硼酸液面下，在螺旋夾a關(guān)閉,，螺旋夾b開啟的狀態(tài)下,，準(zhǔn)確吸取10.0mL樣品消化液，由小漏斗流入反應(yīng)室,，并以10mL蒸餾水洗滌進(jìn)樣口流入反應(yīng)室,，棒狀玻塞塞緊。使10mL氫氧化鈉溶液倒入小玻杯,，提起玻塞使其緩緩流入反應(yīng)室,，用少量水沖洗立即將玻塞蓋堅，并加水于小玻杯以防漏氣,，開啟螺旋夾a,，關(guān)閉螺旋夾b，開始蒸餾,。通入蒸汽蒸騰10min后,，移動接收瓶，液面離開凝管下端,，再蒸餾2min,。然后用少量水沖洗冷凝管下端外部，取下三角瓶,，準(zhǔn)備滴定,。
同時吸取10.0mL試劑空白消化液按上法蒸餾操作。
4、樣品滴定
以0.01mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至灰色為終點,。
5,、數(shù)據(jù)記錄
項目  *次  第二次  第三次
樣品消化液（mL）
滴定消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（mL）
消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液平均值（mL）
結(jié)果計算
式中X——樣品蛋白質(zhì)含量（g/100g）；
V1——樣品滴定消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（mL）,；
V2——空白滴定消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（mL）；
c——鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度（mol/L）,；
0.0140——1.0mL鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量（g）,；
m——樣品的質(zhì)量（g）；
F——氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù),，一般食物為6.25,；乳制品為6.38；面粉為5.70,；
高梁為6.24,；花生為5.46；米為5.95,；大豆及其制品為5.71,；肉與肉制品為
6.25；大麥,、小米,、燕麥、裸麥為5.83,；芝麻,、向日葵5.30。
計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字,。
注意事項及說明
1,、本法也適用于半固體試樣以及液體樣品檢測。半固體試樣一般取樣范圍為2.00g~5.00g,；液體樣品取樣10.0mL~25.0mL（約相當(dāng)?shù)?0mg~40mg）,。若檢測液體樣品，結(jié)果以g/100mL表示,。
2,、消化時，若樣品含糖高或含脂及較多時,，注意控制加熱溫度,，以免大量泡沫噴出凱氏燒瓶，造成樣品損失,?？杉尤肷倭啃链蓟蛞后w石蠟，或硅消泡劑減少泡沫產(chǎn)生。
3,、消化時應(yīng)注意旋轉(zhuǎn)凱氏燒瓶,，將附在瓶壁上的碳粒沖下，對樣品*消化,。若樣品不易消化至澄清透明,，可將凱氏燒瓶中溶液冷卻，加入數(shù)滴過氧化氫后,，再繼續(xù)加熱消化至*,。
4、硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超過40℃,，否則氨吸收減弱,，造成檢測結(jié)果偏低?？砂呀邮掌恐糜诶渌≈?。
5、在重復(fù)性條件下獲得兩次獨立測定結(jié)果的差值不得超過算術(shù)平均值的10%,。
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