色譜法,，又稱層析法,。根據(jù)其分離原理,，有吸附色譜、分配色譜,、離子交換色譜與排阻色譜等方法,。 吸附色譜是利用吸附劑對(duì)被分離物質(zhì)的吸附能力不同，用溶劑或氣體洗脫,，以使組分分離,。常用的吸附劑有氧化鋁、硅膠,、聚酰胺等有吸附活性的物質(zhì),。 分配色譜是利用溶液中被分離物質(zhì)在兩相中分配系數(shù)不同，以使組分分離,。其中一相為液體,，涂布或使之鍵合在固體載體上，稱固定相,；另一相為液體或氣體,，稱流動(dòng)相。常用的載體有硅膠,、硅藻土,、硅鎂型吸附劑與纖維素粉等。 離子交換色譜是利用被分離物質(zhì)在離子交換樹脂上的離子交換勢(shì)不同而使組分分離,。常用的有不同強(qiáng)度的陽(yáng),、陰離子交換樹脂，流動(dòng)相一般為水或含有有機(jī)溶劑的緩沖液,。 排阻色譜又稱凝膠色譜或凝膠滲透色譜,，是利用被分離物質(zhì)分子量大小的不同和在填料上滲透程度的不同，以使組分分離,。常用的填料有分子篩,、葡聚糖凝膠、微孔聚合物,、微孔硅膠或玻璃珠等,，可根據(jù)載體和試樣的性質(zhì),，選用水或有機(jī)溶劑為流動(dòng)相。 色譜法的分離方法,，有柱色譜法,、紙色譜法、薄層色譜法,、氣相色譜法,、液相色譜法等。色譜所用溶劑應(yīng)與試樣不起化學(xué)反應(yīng),，并應(yīng)用純度較高的溶劑,。色譜時(shí)的溫度，除氣相色譜法或另有規(guī)定外,，系指在室溫下操作,。 分離后各成分的檢出，應(yīng)采用各單體中規(guī)定的方法,。通常用柱色譜,、紙色譜或薄層色譜分離有色物質(zhì)時(shí)，可根據(jù)其色帶進(jìn)行區(qū)分,，對(duì)有些無(wú)色物質(zhì),，可在245-365nm的紫外燈下檢視。紙色譜或薄層色譜也可噴顯色劑使之顯色,。薄層色譜還可用加有熒光物質(zhì)的薄層硅膠,，采用熒光熄滅法檢視。用紙色譜進(jìn)行定量測(cè)定時(shí),，可將色譜斑點(diǎn)部分剪下或挖取,，用溶劑溶出該成分，再用分光光度法或比色法測(cè)定,，也可用色譜掃描儀直接在紙或薄層板上測(cè)出,，也可用色譜掃描儀直接以紙或薄層板上測(cè)出。柱色譜,、氣相色譜和液相色譜可用接于色譜柱出口處的各種檢測(cè)器檢測(cè),。柱色譜還可分部收集流出液后用適宜方法測(cè)定。柱色譜法 所用色譜管為內(nèi)徑均勻,、下端縮口的硬質(zhì)玻璃管,，下端用棉花或玻璃纖維塞住，管內(nèi)裝有吸附劑,。色譜柱的大小,，吸附劑的品種和用量，以及洗脫時(shí)的流速，均按各單體中的規(guī)定,。吸附劑的顆粒應(yīng)盡可能保持大小均勻,，以保證良好的分離效果，除另有規(guī)定外通常多采用直徑為0.07-0.15mm的顆粒,。吸附劑的活性或吸附力對(duì)分離效果有影響,，應(yīng)予注意。 吸附劑的填裝 干法：將吸附劑一次加入色譜管,，振動(dòng)管壁使其均勻下沉,，然后沿管壁緩緩加入開始層析時(shí)使用的流動(dòng)相，或?qū)⑸V管下端出口加活塞,，加入適量的流動(dòng)相，旋開活使流動(dòng)相緩緩滴出,，然后自管頂緩緩加入吸附劑,，使其均勻地潤(rùn)濕下沉，在管內(nèi)形成松緊適度的吸附層,。操作過(guò)程中應(yīng)保持有充分的流動(dòng)相留在吸附層的上面,。濕法：將吸附劑與流動(dòng)相混合，攪拌以除去空氣泡,，徐徐傾入色譜管中,，然后再加入流動(dòng)相，將附著于管壁的吸附劑洗下,，使色譜柱表面平整,。 俟填裝吸附劑所用流動(dòng)相從色譜柱自然流下，液面將柱表面相平時(shí),，即加試樣溶液,。 試樣的加入 除另有規(guī)定外，將試樣溶于層析時(shí)使用的流動(dòng)相中,，再沿色譜管壁緩緩加入,。注意勿使吸附劑翻起?；?qū)⒃嚇尤苡谶m當(dāng)?shù)娜軇┲?。與少量吸附劑混勻，再使溶劑揮發(fā)去盡后使呈松散狀,；將混有試樣的吸附劑加在已制備好的色譜柱上面,。如試樣在常用溶劑中不溶解，可將試樣與適量的吸附劑在乳缽中研磨混勻后加入,。 洗脫 除另有規(guī)定外,，通常按流動(dòng)相洗脫能力大小，遞增變換流動(dòng)相的品種和比例，分別分部收集流出液,，至流出液中所含成分顯著減少或不再含有時(shí),，再改變流動(dòng)相的品種和比例。操作過(guò)程中應(yīng)保持有充分的流動(dòng)相留在吸附層的上面,。紙色譜法 以紙為載體,，用單一溶劑或混合溶劑進(jìn)行分配。亦即以紙上所含水分或其他物質(zhì)為固定相,，用流動(dòng)相進(jìn)行展開的分配色譜法,。 所用濾紙應(yīng)質(zhì)地均勻平整，具有一定機(jī)械強(qiáng)度,，必須不含會(huì)影響色譜效果的雜質(zhì),，也不應(yīng)與所用顯色劑起作用，以免影響分離和鑒別效果,，必要時(shí)可作特殊處理后再用,。 試樣經(jīng)層析后可用比移值（Rf）表示各組成成分的位置（比移值=原點(diǎn)中心至色譜斑點(diǎn)中心的距離與原點(diǎn)中心至流動(dòng)相前沿的距離之比），由于影響比移值的因素較多,，因此一般采用在相同實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)照物質(zhì)對(duì)比以確定其異同,。作為單體鑒別時(shí)，試樣所顯主色譜斑點(diǎn)的顏色（或熒光）與供置,，應(yīng)與對(duì)照（標(biāo)準(zhǔn)）樣所顯主色的譜斑點(diǎn)或供試品-對(duì)照品（1∶1）混合所顯的主色譜斑點(diǎn)相同,。作為質(zhì)量指標(biāo)（純度）檢查時(shí)，可取一定量的試樣,，經(jīng)展開后,，按各單體的規(guī)定，檢視其所顯雜質(zhì)色譜斑點(diǎn)的個(gè)數(shù)或呈色（或熒光）的強(qiáng)度,。作為含量測(cè)定時(shí),，可將色譜斑點(diǎn)剪下洗脫后，再用適宜的方法測(cè)定,，也可用色譜掃描儀測(cè)定,。 1、下行法 所用色譜缸一般為圓形或長(zhǎng)方形玻璃缸,，缸上有磨口玻璃蓋,，應(yīng)能密閉，蓋上有孔,，可插入分液漏斗,，以加入流動(dòng)相。在近缸頂端有一用支架架起的玻璃槽作為流動(dòng)相的容器,，槽內(nèi)有一玻璃棒,，用以支持色譜濾紙使其自然下垂,，避免流動(dòng)相沿濾紙與溶劑槽之間發(fā)生虹吸現(xiàn)象。 取適當(dāng)?shù)纳V濾紙按纖維長(zhǎng)絲方向切成適當(dāng)大小的紙條,，離紙條上端適當(dāng)?shù)木嚯x（使色譜紙上端能足夠浸入溶劑槽內(nèi)的流動(dòng)相中,，并使點(diǎn)樣基線能在溶劑槽側(cè)的玻璃支持棒下數(shù)厘米處）用鉛筆劃一點(diǎn)樣基線，必要時(shí)色譜紙下端可切成鋸齒形,，以便于流動(dòng)相滴下,。 將試樣溶于適當(dāng)?shù)娜軇┲校瞥梢欢舛鹊娜軇?。用微量吸管或微量注射器吸取溶劑,，點(diǎn)于點(diǎn)樣基線上，溶液宜分次點(diǎn)加,，每次點(diǎn)加后,，俟其自然干燥、低溫烘干或經(jīng)溫?zé)釟饬鞔蹈?。樣點(diǎn)直徑一般不超過(guò)0.5cm,，樣點(diǎn)通常應(yīng)為圓形。 將點(diǎn)樣后的色譜濾紙上端放在溶劑槽內(nèi),，并用玻璃棒壓住，使色譜紙通過(guò)槽側(cè)玻璃支持棒自然下垂,，點(diǎn)樣基線在支持棒下數(shù)厘米處,。色譜開始前，色譜缸內(nèi)用各單體中所規(guī)定的溶劑的蒸氣飽和,，一般可在色譜缸底部放一裝有流動(dòng)相的平皿,，或?qū)⒔辛鲃?dòng)相的濾紙條附著在色譜缸的內(nèi)壁上，放置一定時(shí)間,，俟溶劑揮發(fā)使缸內(nèi)充滿飽和蒸氣,。然后添加流動(dòng)相，使浸沒(méi)溶劑槽內(nèi)濾紙,，流動(dòng)相即經(jīng)毛細(xì)管作用沿濾紙移動(dòng)進(jìn)行展開至規(guī)定距離后,，取出濾紙，標(biāo)明流動(dòng)相前沿位置,，俟流動(dòng)相揮散后按規(guī)定方法檢出色譜斑點(diǎn),。 2、上行法 色譜缸基本和下行法相似,，唯除去溶劑槽和支架,，并在色譜缸蓋上的孔中加塞，塞中插入玻璃懸鉤,，以便將點(diǎn)樣后的色譜濾紙掛在鉤上,。色譜濾紙一般長(zhǎng)約25cm，寬度則視需要而定。必要時(shí)可將色譜濾紙卷成筒形,。點(diǎn)樣基線距底邊約2.5cm,，點(diǎn)樣方法與下行法相同。色譜缸內(nèi)加入適量流動(dòng)相,，放置,，俟流動(dòng)相蒸氣飽和后，再下降懸鉤,，使色譜濾紙浸入流動(dòng)相約0.5cm,，流動(dòng)相即經(jīng)毛細(xì)管作用沿色譜濾紙上升，除另有規(guī)定外,，一般展開至15cm后,，取出晾干，按規(guī)定方法檢視,。 色譜可以向一個(gè)方向進(jìn)行,，即單向色譜；也可進(jìn)行雙向色譜,，即先向一個(gè)方向展開,，取出，俟流動(dòng)相*揮發(fā)后,，將濾紙轉(zhuǎn)90°,，再用原流動(dòng)相或另一種流動(dòng)相進(jìn)行展。亦可多次展開,，連續(xù)展或徑向色譜等,。薄層色譜法 按各單體所規(guī)定的載體，放入適當(dāng)容器,，加入適量水以配成懸浮液,，在厚度均勻一致的50×200mm或200×200mm平滑玻璃板上將此懸浮液均布成0.25mm的厚度，風(fēng)干后一般在110度下干燥0.5-1h（或按單體規(guī)定）,。 以離薄層板一端約25mm的位置作為點(diǎn)樣基線,，用微量吸管按規(guī)定量吸取試樣液和對(duì)照（標(biāo)準(zhǔn)）液，點(diǎn)于基線上,，點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離在10mm以上,，液點(diǎn)的直徑約3mm，風(fēng)干后,，基線一端向下,，將薄層板放入展開溶劑，溶劑層深10mm,，并預(yù)經(jīng)開展溶劑的蒸汽飽和,。在展開溶劑從基線上升至規(guī)定距離（一般為15cm）后,，取出薄層板，風(fēng)干,，然后按規(guī)定的方法,，對(duì)斑點(diǎn)的位置和顏色進(jìn)行檢查。氣相色譜法 氣相色譜法是在以適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嘧龀傻闹軆?nèi),，利用氣體（載氣）作為移動(dòng)相,，使試樣（氣體、液體或固體）在氣體狀態(tài)下展開,，在色譜柱內(nèi)分離后,，各種成分先后進(jìn)入檢測(cè)器，用記錄儀記錄色譜譜圖,。 在對(duì)裝置進(jìn)行調(diào)試后,，按各單體的規(guī)定條件調(diào)整柱管、檢測(cè)器,、溫度和載氣流量,。進(jìn)樣口溫度一般應(yīng)高于柱溫30-50度。如用火焰電離檢測(cè)器,，其溫度應(yīng)等于或高于柱溫,，但不得低于100度，以免水汽凝結(jié),。色譜上分析成分的峰的位置,，以滯留時(shí)間（從注入試樣液到出現(xiàn)成分zui高峰的時(shí)間）和滯留容量（滯留時(shí)間×載氣流量）來(lái)表示。這些在一定條件下,，就能反應(yīng)出物質(zhì)所具有特殊值，并據(jù)此確定試樣成分,。 根據(jù)色譜上出現(xiàn)的物質(zhì)成分的峰面積或峰高進(jìn)行定量,。峰面積可用面積測(cè)定儀測(cè)定，按半寬度法求得（即以峰1/2處的峰寬×峰高求得）,。峰高的測(cè)定方法是從峰高的頂點(diǎn)向記錄紙橫座標(biāo)準(zhǔn)垂線,，找出此垂線與峰的兩下端聯(lián)結(jié)線的交點(diǎn)，即以此交點(diǎn)至峰頂點(diǎn)的距離長(zhǎng)度為峰高,。定量方法可分以下三種： 1,、內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)法 取標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)成分，按依次增加或減少的已知階段量,，各自分別加入各單體所規(guī)定的定量?jī)?nèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中,，調(diào)制標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取此標(biāo)準(zhǔn)液的一定量注入色譜柱,，根據(jù)色譜圖取標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)成分的峰面積和峰高和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積和峰高的比例為縱座標(biāo),，取標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)成分量和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量之比,，或標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)成分量為橫坐標(biāo)，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線,。 然后按單體中所規(guī)定的方法調(diào)制試樣液,。在調(diào)制試樣液時(shí)，預(yù)先加入與調(diào)制標(biāo)準(zhǔn)液時(shí)等量的內(nèi)標(biāo)物質(zhì),。然后按制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)的同樣條件下得出的色譜,，求出被測(cè)成分的峰面積或峰高和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰積或峰高之比，再按標(biāo)準(zhǔn)曲線求出被測(cè)成分的含量,。 所用的內(nèi)標(biāo)物質(zhì),，應(yīng)采用其峰面積的位置與被測(cè)成分的峰的位置盡可能接近并與被測(cè)成分以外的峰位置*分離的穩(wěn)定的物質(zhì)。 2,、標(biāo)準(zhǔn)曲線法 取標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)成分 按依次增加或減少階段法,，各自調(diào)制成標(biāo)準(zhǔn)液，注入一定量后,，按色譜圖取標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)成分的峰面積或峰高為縱座標(biāo),，而以標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)成分的含量為橫坐標(biāo)，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線,。然后按單體中所規(guī)定的方法制備試樣液,。取試樣液按制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)相同的條件作出色譜，求出被測(cè)成分的峰面積和峰高,，再按標(biāo)準(zhǔn)曲線求出被測(cè)成分的含量,。 3、峰面積百分率法 以色譜中所得各種成分的峰面積的總和為100,，按各成分的峰面積總和之比,，求出各成分的組成比率。氣液色譜法 這時(shí)所指的氣液色譜法,，主要用于各種香料物質(zhì)的分析,，基本條件和參數(shù)主要依照美國(guó)精油協(xié)會(huì)（EOA）于1979年所建議的方法。其基本原理,、操作,、標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)等均與上述氣相色譜法相同。 1,、柱 用304號(hào)合金所制不銹鋼管,，長(zhǎng)3m，內(nèi)徑2.16-2.57mm,，外徑3.18mm,。底物：極性柱為聚乙二醇20M（Carbowax 20M）,分子量約2萬(wàn)；非極性柱為氣相色譜級(jí)甲基硅氧烷（SE-30）,，或二甲基硅氧烷（OV-1或OV-101）,。底物濃度：重量的105,。固體載體：10目或20目熔融煅燒過(guò)的硅藻土，經(jīng)硅烷化和酸洗后,，其自由傾落密度為0.2g/cm3,，zui小120目，zui大80目,。裝填密度每cm3應(yīng)大于0.24g,。 2、載氣 氦,。zui低流量為每分鐘25-50ml,。分析狀態(tài)極性柱：起始溫度,，zui低75度,；zui終溫度，zui高225度,。升溫速度,，每分鐘2-8度。非極性柱：起始溫度,，zui低75度,；zui終溫度，不超過(guò)275度,；升溫速度,，每分鐘2-8度。進(jìn)樣溫度：225-250度,。試樣量：0.1-1ul,。檢測(cè)器：用熱導(dǎo)池。檢測(cè)器的操作條件應(yīng)維持恒定,。