用生化培養(yǎng)箱做免疫熒光實驗的流程如下： 1,、細胞準備 （1）取出生長狀態(tài)良好的細胞,，棄培養(yǎng)基，消化重懸細胞,。（2）將24孔圓形爬片放入24孔板的孔中,。 （3）根據(jù)細胞生長特性取適量細胞于已鋪爬片的24孔板中，放入37℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng),。 2,、固定 （1）取出細胞，棄去培養(yǎng)基,，用PBS洗細胞3次,。 （2）每孔加入1mL的4%多聚甲醛，室溫固定10-20min,，棄去多聚甲醛,； （3）加入1mL的PBS清洗細胞，重復(fù)兩次,。 3,、通透 （1）每孔加入1mL的0.5% Triton-X100 ，室溫10min,，棄去Triton-X100,。 （2）加入1mL的PBS清洗細胞，5min,，棄PBS,。重復(fù)兩次。 4,、封閉 每孔中加入1mL的3%BSA封閉液,，室溫封閉1h。棄封閉液。 5,、一抗結(jié)合 （1）向爬片上滴加稀釋好的一抗,，用錫箔紙包住24孔板外面，輕柔的將24 孔板放置于4℃生化培養(yǎng)箱中,，過夜孵育,。 （2）加入1mL的PBS清洗細胞，5min,，棄PBS,。重復(fù)五次。 6,、二抗結(jié)合 （1）加封閉液稀釋的二抗室溫避光孵育1h,。 （2）加入1mL的PBS清洗細胞，5min,，棄PBS,。重復(fù)五次。 7,、DAPI染色 （1）按照1：4000比例用1×PBS稀釋DAPI工作液（參照廠家說明書）,，并向每個孔中加入1mL的DAPI工作液，避光靜置染色10min,。 （2）加入1mL的PBS清洗細胞,，5min，棄PBS,。重復(fù)三次,。 8、封片及檢測 （1）將爬片小心取出,，用吸水紙吸干多余液體,，加5μl的抗熒光淬滅劑到載玻片上。 （2）將爬片倒置載玻片上,，周圍涂指甲油固定,。 （3）4℃生化培養(yǎng)箱暫存或直接激光共聚焦顯微鏡拍攝。
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