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慢病毒包裝詳細(xì)過程

閱讀:1319      發(fā)布時(shí)間:2024-3-14
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一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1,、健康的HEK 293T細(xì)胞,,一般使用復(fù)蘇后10代以內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行慢病毒的生產(chǎn),要求無細(xì)菌,、真菌以及支原體污染,;

2,、轉(zhuǎn)染試劑,如PEI,、Higene,、lipo2000lipo3000

各種轉(zhuǎn)染試劑的步驟稍有差別,小助手以PEI為轉(zhuǎn)染試劑,。

3,、DMEM無血清無雙抗培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基(10%FBS1%P/S),;

4,、10mL無菌注射器(環(huán)氧乙烷滅菌處理)

5,、0.45μm的細(xì)菌濾器,。

二、包裝步驟

Day1

7:00 PM)鋪板HEK 293T細(xì)胞

數(shù)量:400/10 cm dish ,;覺得計(jì)數(shù)麻煩的話,,可以在293T細(xì)胞長(zhǎng)到約90%匯合時(shí),1:5傳代(均分成5份),,每1份的數(shù)目差不多就是400萬了,。

Day2

3:00 PM)三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

在培養(yǎng)箱中恢復(fù)細(xì)胞狀態(tài)約20h,此時(shí)可進(jìn)行轉(zhuǎn)染,。三質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染體系三種質(zhì)粒的配比有許多種方式,,目前MDL使用4:3:1的比例,即PxpAx2PMD2gPLVX(載有你基因的質(zhì)粒),。10cm dish一般轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的總質(zhì)量為20μg,,PEI的量為質(zhì)粒的2.5-3倍(也就是50μg-60μg,一般推薦按照2.5倍來),。按照比例算下來,,PxpAx2PMD2gPLVX的質(zhì)量比為:(10ug:7.5ug:2.5ug)

注意:在提到質(zhì)粒的量時(shí),千萬記得說質(zhì)量而不是濃度,,不然容易出錯(cuò),。

實(shí)驗(yàn)步驟:

取如上總質(zhì)量為20μg的質(zhì)粒添加到總體積500μLDMEM無血清無雙抗培養(yǎng)基中,記為A液,,移液槍混勻20次,;

PEI(一般配置成1μg/mL)50-60μg(也就是50-60μL)添加到總體積500μLDMEM無血清無雙抗培養(yǎng)基中,記為B液,,移液槍混勻20次;

B液逐滴滴加到A液中,,移液槍輕柔混勻66次,,室溫靜置15-20min,;

將靜置好的轉(zhuǎn)染試劑(A+B)緩緩滴加到恢復(fù)狀態(tài)20hHEK 293T細(xì)胞中。

做好標(biāo)記,,記好轉(zhuǎn)染時(shí)間,、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、換液時(shí)間等參數(shù)提高實(shí)驗(yàn)重復(fù)性,。

Day3

9:00 AM)換液

轉(zhuǎn)染后的第18h,,將含有轉(zhuǎn)染試劑的HEK 293T上清更換為10mL DMEM培養(yǎng)基;對(duì)于新手,,為了防止在換液時(shí)將細(xì)胞吹散,,可以留3mL的液體在dish中,更換8mL DMEM培養(yǎng)基,。

Day4

3:00 PM)收集病毒液

在轉(zhuǎn)染后的48-72h,,為病毒生產(chǎn)的高峰期,一般我們收集轉(zhuǎn)染后48h(換液后30h,,產(chǎn)毒30h)的病毒液用于實(shí)驗(yàn),,足以滿足大部分實(shí)驗(yàn)需求。收集病毒于15mL tube中,,500g,,5mL離心去細(xì)胞碎片和雜質(zhì),隨后使用注射器和濾器進(jìn)行過濾,。收集后的病毒上清可以用來進(jìn)行感染和儲(chǔ)存,。

三、慢病毒滴度測(cè)定

病毒滴度的單位為:TU/mL,,代表每毫升病毒液中具有轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的病毒顆粒的數(shù)目,。

計(jì)算公式為:滴度=(感染時(shí)細(xì)胞數(shù)(個(gè))*陽(yáng)性細(xì)胞%/病毒液體積(mL

病毒液體積和感染時(shí)細(xì)胞數(shù)已知,需通過流式細(xì)胞術(shù)確認(rèn)陽(yáng)性細(xì)胞百分比,。

滴度測(cè)定常常使用HEK 293T細(xì)胞,,大致的原理為,將在DAY3收集到的病毒上清,,按照梯度添加到293T細(xì)胞中,,感染后48h檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞的比例,從而確定病毒的滴度,。

四,、注意事項(xiàng)

293T細(xì)胞的代數(shù)最好用15代以內(nèi),最多不超過20代,,否則影響轉(zhuǎn)染效率,。質(zhì)粒濃度在400-1000ng/μL范圍,純度260/2801.8-2.0之間的轉(zhuǎn)染效率較高?;旌象w輕輕滴入細(xì)胞上清后搖勻,,動(dòng)作要輕,293T細(xì)胞貼壁不牢避免細(xì)胞脫落,。





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