一,、實驗準備
1、健康的HEK 293T細胞,，一般使用復(fù)蘇后10代以內(nèi)的細胞進行慢病毒的生產(chǎn),，要求無細菌、真菌以及支原體污染,；
2,、轉(zhuǎn)染試劑，如PEI,、Higene,、lipo2000或lipo3000
各種轉(zhuǎn)染試劑的步驟稍有差別，小助手以PEI為轉(zhuǎn)染試劑,。
3,、DMEM無血清無雙抗培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基（10%FBS和1%P/S）,；
4,、10mL無菌注射器(環(huán)氧乙烷滅菌處理)；
5,、0.45μm的細菌濾器,。
二、包裝步驟
Day1
（7:00 PM）鋪板HEK 293T細胞
數(shù)量：400萬/10 cm dish ,；覺得計數(shù)麻煩的話,，可以在293T細胞長到約90%匯合時，1:5傳代（均分成5份）,，每1份的數(shù)目差不多就是400萬了,。
Day2
（3:00 PM）三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
在培養(yǎng)箱中恢復(fù)細胞狀態(tài)約20h,，此時可進行轉(zhuǎn)染。三質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染體系三種質(zhì)粒的配比有許多種方式,，目前MDL使用4:3:1的比例,，即PxpAx2：PMD2g：PLVX(載有你基因的質(zhì)粒)。10cm dish一般轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的總質(zhì)量為20μg,，PEI的量為質(zhì)粒的2.5-3倍（也就是50μg-60μg,，一般推薦按照2.5倍來）。按照比例算下來,，PxpAx2：PMD2g：PLVX的質(zhì)量比為：(10ug:7.5ug:2.5ug)
注意：在提到質(zhì)粒的量時,，千萬記得說質(zhì)量而不是濃度，不然容易出錯,。
實驗步驟：
取如上總質(zhì)量為20μg的質(zhì)粒添加到總體積500μL的DMEM無血清無雙抗培養(yǎng)基中,，記為A液，移液槍混勻20次,；
取PEI(一般配置成1μg/mL)50-60μg（也就是50-60μL）添加到總體積500μL的DMEM無血清無雙抗培養(yǎng)基中,，記為B液，移液槍混勻20次,；
將B液逐滴滴加到A液中,，移液槍輕柔混勻66次，室溫靜置15-20min,；
將靜置好的轉(zhuǎn)染試劑（A+B）緩緩滴加到恢復(fù)狀態(tài)20h的HEK 293T細胞中,。
做好標記，記好轉(zhuǎn)染時間,、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒,、換液時間等參數(shù)提高實驗重復(fù)性。
Day3
（9:00 AM）換液
轉(zhuǎn)染后的第18h,，將含有轉(zhuǎn)染試劑的HEK 293T上清更換為10mL DMEM培養(yǎng)基,；對于新手，為了防止在換液時將細胞吹散,，可以留3mL的液體在dish中,，更換8mL DMEM培養(yǎng)基。
Day4
（3:00 PM）收集病毒液
在轉(zhuǎn)染后的48-72h,，為病毒生產(chǎn)的高峰期,，一般我們收集轉(zhuǎn)染后48h（換液后30h，產(chǎn)毒30h）的病毒液用于實驗,，足以滿足大部分實驗需求,。收集病毒于15mL tube中，500g,，5mL離心去細胞碎片和雜質(zhì),，隨后使用注射器和濾器進行過濾。收集后的病毒上清可以用來進行感染和儲存,。
三,、慢病毒滴度測定
病毒滴度的單位為：TU/mL，代表每毫升病毒液中具有轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的病毒顆粒的數(shù)目,。
計算公式為：滴度=（感染時細胞數(shù)（個）*陽性細胞%）/病毒液體積（mL）
病毒液體積和感染時細胞數(shù)已知,，需通過流式細胞術(shù)確認陽性細胞百分比。
滴度測定常常使用HEK 293T細胞,，大致的原理為,，將在DAY3收集到的病毒上清，按照梯度添加到293T細胞中,，感染后48h檢測陽性細胞的比例,，從而確定病毒的滴度。
四,、注意事項
293T細胞的代數(shù)最好用15代以內(nèi),，最多不超過20代，否則影響轉(zhuǎn)染效率,。質(zhì)粒濃度在400-1000ng/μL范圍,，純度260/280在1.8-2.0之間的轉(zhuǎn)染效率較高?；旌象w輕輕滴入細胞上清后搖勻,，動作要輕，293T細胞貼壁不牢避免細胞脫落,。
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