日韩av大片在线观看欧美成人不卡|午夜先锋看片|中国女人18毛片水多|免费xx高潮喷水|国产大片美女av|丰满老熟妇好大bbbbbbbbbbb|人妻上司四区|japanese人妻少妇乱中文|少妇做爰喷水高潮受不了|美女人妻被颜射的视频,亚洲国产精品久久艾草一,俄罗斯6一一11萝裸体自慰,午夜三级理论在线观看无码

一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1,、健康的HEK 293T細(xì)胞,，一般使用復(fù)蘇后10代以內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行慢病毒的生產(chǎn)，要求無細(xì)菌,、真菌以及支原體污染,；

2,、轉(zhuǎn)染試劑，如PEI,、Higene,、lipo2000或lipo3000

各種轉(zhuǎn)染試劑的步驟稍有差別，小助手以PEI為轉(zhuǎn)染試劑,。

3,、DMEM無血清無雙抗培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基（10%FBS和1%P/S）,；

4,、10mL無菌注射器(環(huán)氧乙烷滅菌處理)；

5,、0.45μm的細(xì)菌濾器,。

二、包裝步驟

Day1

（7:00 PM）鋪板HEK 293T細(xì)胞

數(shù)量：400萬/10 cm dish ,；覺得計(jì)數(shù)麻煩的話,，可以在293T細(xì)胞長(zhǎng)到約90%匯合時(shí)，1:5傳代（均分成5份）,，每1份的數(shù)目差不多就是400萬了,。

Day2

（3:00 PM）三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

在培養(yǎng)箱中恢復(fù)細(xì)胞狀態(tài)約20h，此時(shí)可進(jìn)行轉(zhuǎn)染,。三質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染體系三種質(zhì)粒的配比有許多種方式,，目前MDL使用4:3:1的比例，即PxpAx2：PMD2g：PLVX(載有你基因的質(zhì)粒),。10cm dish一般轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的總質(zhì)量為20μg,，PEI的量為質(zhì)粒的2.5-3倍（也就是50μg-60μg，一般推薦按照2.5倍來）,。按照比例算下來,，PxpAx2：PMD2g：PLVX的質(zhì)量比為：(10ug:7.5ug:2.5ug)

注意：在提到質(zhì)粒的量時(shí)，千萬記得說質(zhì)量而不是濃度,，不然容易出錯(cuò),。

實(shí)驗(yàn)步驟：

取如上總質(zhì)量為20μg的質(zhì)粒添加到總體積500μL的DMEM無血清無雙抗培養(yǎng)基中，記為A液,，移液槍混勻20次,；

取PEI(一般配置成1μg/mL)50-60μg（也就是50-60μL）添加到總體積500μL的DMEM無血清無雙抗培養(yǎng)基中，記為B液,，移液槍混勻20次；

將B液逐滴滴加到A液中,，移液槍輕柔混勻66次,，室溫靜置15-20min,；

將靜置好的轉(zhuǎn)染試劑（A+B）緩緩滴加到恢復(fù)狀態(tài)20h的HEK 293T細(xì)胞中。

做好標(biāo)記,，記好轉(zhuǎn)染時(shí)間,、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、換液時(shí)間等參數(shù)提高實(shí)驗(yàn)重復(fù)性,。

Day3

（9:00 AM）換液

轉(zhuǎn)染后的第18h,，將含有轉(zhuǎn)染試劑的HEK 293T上清更換為10mL DMEM培養(yǎng)基；對(duì)于新手,，為了防止在換液時(shí)將細(xì)胞吹散,，可以留3mL的液體在dish中，更換8mL DMEM培養(yǎng)基,。

Day4

（3:00 PM）收集病毒液

在轉(zhuǎn)染后的48-72h,，為病毒生產(chǎn)的高峰期，一般我們收集轉(zhuǎn)染后48h（換液后30h,，產(chǎn)毒30h）的病毒液用于實(shí)驗(yàn),，足以滿足大部分實(shí)驗(yàn)需求。收集病毒于15mL tube中,，500g,，5mL離心去細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，隨后使用注射器和濾器進(jìn)行過濾,。收集后的病毒上清可以用來進(jìn)行感染和儲(chǔ)存,。

三、慢病毒滴度測(cè)定

病毒滴度的單位為：TU/mL,，代表每毫升病毒液中具有轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的病毒顆粒的數(shù)目,。

計(jì)算公式為：滴度=（感染時(shí)細(xì)胞數(shù)（個(gè)）*陽(yáng)性細(xì)胞%）/病毒液體積（mL）

病毒液體積和感染時(shí)細(xì)胞數(shù)已知，需通過流式細(xì)胞術(shù)確認(rèn)陽(yáng)性細(xì)胞百分比,。

滴度測(cè)定常常使用HEK 293T細(xì)胞,，大致的原理為，將在DAY3收集到的病毒上清,，按照梯度添加到293T細(xì)胞中,，感染后48h檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞的比例，從而確定病毒的滴度,。

四,、注意事項(xiàng)

293T細(xì)胞的代數(shù)最好用15代以內(nèi)，最多不超過20代,，否則影響轉(zhuǎn)染效率,。質(zhì)粒濃度在400-1000ng/μL范圍，純度260/280在1.8-2.0之間的轉(zhuǎn)染效率較高?；旌象w輕輕滴入細(xì)胞上清后搖勻,，動(dòng)作要輕，293T細(xì)胞貼壁不牢避免細(xì)胞脫落,。