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（1） 準(zhǔn)備

   無菌超凈臺(tái)，酒精燈,，75%酒精噴壺，二氧化碳培養(yǎng)箱,，37℃水浴鍋，離心機(jī),；培養(yǎng)瓶,，含10%胎牛血清的*培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及PBS磷酸緩沖液（提前放置超凈臺(tái)使平衡到室溫）,，無菌工作服（白大褂），手套,，記號(hào)筆

（2） 步驟

   1.穿好無菌工作服，帶上*罩和手套,，快速從液氮里取出凍存管,，快速放進(jìn)37℃水浴鍋緩慢搖晃使細(xì)胞解凍，注意凍存管的封口膜不要破裂,，防止污染,。

   2.解凍后用紙擦干凍存管表面的水滴，酒精噴壺噴灑適量75%酒精消毒凍存管封口處,。

   3.開超凈臺(tái),，點(diǎn)燃酒精燈燃燒片刻后（可提前準(zhǔn)備），凍存管放超凈臺(tái),，換新手套，小心打開凍存管,，避免污染,，無菌吸管將1ml細(xì)胞全部吸出至5ml無菌EP管，補(bǔ)加9ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋,，1000rpm，離心5min使細(xì)胞沉淀,，棄上清,。

   4.加入新鮮配制的含10%血清的培養(yǎng)基4ml，輕輕混勻,，用吸管將細(xì)胞移至25T培養(yǎng)瓶。

   5.平躺放置培養(yǎng)瓶,，8字形混勻后,，置于37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng),。

   6.培養(yǎng)24小時(shí)后,，顯微鏡觀察細(xì)胞（貼壁細(xì)胞）貼壁后,，小心更換培養(yǎng)基,，根據(jù)不同細(xì)胞的生長狀態(tài)進(jìn)行傳代培養(yǎng),，培養(yǎng)瓶上標(biāo)記：操作者,，時(shí)間，細(xì)胞類型,。

   7.有的實(shí)驗(yàn)員的培養(yǎng)基會(huì)加入抗生素防止細(xì)胞污染,，但是這對(duì)于掌握細(xì)胞培養(yǎng)是非常不利的,，不加抗生素培養(yǎng)細(xì)胞更能提醒實(shí)驗(yàn)者無菌操作的意識(shí),。一旦細(xì)胞出現(xiàn)污染,，易于發(fā)現(xiàn),，一旦發(fā)現(xiàn)污染的細(xì)胞應(yīng)立刻煮沸丟棄,，以免污染同實(shí)驗(yàn)室其他細(xì)胞,。

   8.細(xì)胞長滿90%-100%即可傳代,，小心打開培養(yǎng)瓶,，瓶口過酒精燈消毒,，棄培養(yǎng)基,。

   9.加入1mlPBS,，潤洗細(xì)胞,，重復(fù)3次,，棄PBS,。

   10.加入4ml*培養(yǎng)基，用無菌吸管小心吹打貼壁細(xì)胞或者用胰蛋白酶消化細(xì)胞使細(xì)胞脫落,。

   11.轉(zhuǎn)移1/2脫落的細(xì)胞至新的培養(yǎng)瓶,，各瓶補(bǔ)加*培養(yǎng)基至4ml,。

   12.小心封口，平躺放置培養(yǎng)瓶,，8字形混勻后,，置于37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng),。

   13.待長滿后,，按同樣的方法傳代培養(yǎng),。二  凍存

當(dāng)不需要使用細(xì)胞或者細(xì)胞量足夠時(shí)，可以將細(xì)胞凍存起來,，供以后實(shí)驗(yàn)用

（1） 準(zhǔn)備自

    細(xì)胞凍存液（20%血清,、10%DMSO,、70%基礎(chǔ)培養(yǎng)液）,，梯度降溫盒

（2） 步驟

        1.選取活力好,，密度約70%細(xì)胞用于凍存,，此時(shí)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期,，用于凍存,。

        2 .細(xì)胞吹打或者胰酶消化后,，轉(zhuǎn)移至無菌EP管,，1000rpm里面5min,。

        3.棄上清,，加入新鮮配制的細(xì)胞凍存液,，25T細(xì)胞可以加入2ml細(xì)胞凍存液，分裝2個(gè)凍存管,，細(xì)胞*密度為5*106-1*107個(gè)每ml。

        4.做好標(biāo)記,，放入梯度降溫盒（提前平衡至室溫）,。

        5.將梯度降溫盒放入-80℃冰箱過夜,，DI二天取出凍存管，快速放入液氮保存,。

氧化碳培養(yǎng)箱是進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的必要設(shè)備,，那么在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)有哪些經(jīng)驗(yàn)是我們可以借鑒的呢,？下面讓我們一起來看一下。

1、啟蒙老師的重要性

一般進(jìn)實(shí)驗(yàn)室都有師兄師姐帶著做,，他們就是你做細(xì)胞的啟蒙老師,。他們的操作手法,、細(xì)節(jié)、理論講解就成了你操作的準(zhǔn)則,，如營養(yǎng)液,、細(xì)胞瓶的擺放位置；滅菌處理程序,；開蓋手法,；細(xì)胞吹打手法等等。要學(xué)會(huì)他們的正確操作，在DI一次的時(shí)候就要重視,。

2,、像養(yǎng)孩子一樣養(yǎng)細(xì)胞

細(xì)胞真的很脆弱,，*好每天都去看看它,，以防止出現(xiàn)培養(yǎng)箱缺水,、缺二氧化碳,、停電、溫度不夠等異?，F(xiàn)象,，也好及時(shí)解決這些意外,，避免重復(fù)實(shí)驗(yàn)帶來的更大痛苦,。

3,、好細(xì)胞要及時(shí)保種

細(xì)胞要分批傳代,，這樣即使有一批出了問題,，還有一批備用的,。像后者一般人可能不容易做到。有一次細(xì)胞污染了,，全軍覆沒,。當(dāng)時(shí)可后悔沒有保種,。

4,、每種細(xì)胞都有自己的特性，要區(qū)別對(duì)待,。

細(xì)胞跟人一樣，不同的細(xì)胞,，培養(yǎng)特性是不一樣的,。培養(yǎng)過程中要細(xì)細(xì)體會(huì),。不同細(xì)胞株使用不同的培養(yǎng)基和血清,。

如平滑肌細(xì)胞很活躍，喜歡熱鬧,，2~3 天就好多人口,，而且不太愛吃喝，真是*好養(yǎng)的孩子了,。內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞性格相近,，不過它很不講衛(wèi)生,，也很邋遢，里面有很多分泌屋,，要經(jīng)常換洗才行,。RAW264.7 細(xì)胞也很開朗，而且很能吃,，要經(jīng)常喂它,，頭疼的是細(xì)胞很容易活化，培養(yǎng)它的瓶子和環(huán)境沒有內(nèi)毒素才好,。

5,、培養(yǎng)前的工作準(zhǔn)備充分

包括耗材的處理、試劑的配置,，無菌檢驗(yàn)等等,。
玻璃器皿的清洗。對(duì)于玻璃器皿（細(xì)胞瓶,、裝營養(yǎng)液的瓶子,、小青霉素瓶等）要先用洗衣粉刷干凈（注意死角），然后沖干凈,。用酸液浸泡 24 h 以上,，之后用清水沖洗 10 遍，除去殘留酸液,。瓶子之類,，沖洗過程要使勁搖晃。然后在雙蒸水浸泡 24 h,。晾干后包扎,，160℃ 干烤 2 h 待用。
試劑配置,。細(xì)胞培養(yǎng)用的液體一般使用雙蒸以上的水即可,。并注意 pH 值的調(diào)節(jié)。
無菌檢驗(yàn),。主要采用過濾除菌：如胰酶,、抗生素、G-418 溶液,、各類培養(yǎng)基,、丙酮酸鈉、谷氨酰胺等,。有些可以采用高壓滅菌：如 PBS,、D-Hank's等。

6、試劑分裝保存

包括營養(yǎng)液,、胰酶,、血清等。

血清特別重要,。血清必須貯存于 –20℃,，如果一次無法用完一瓶，可將 40～50ml 分裝于無菌酸處理瓶中,，甚至置青霉素瓶保存,。一般廠商提供的血清為無菌，不需再無菌過濾,。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物,，則可將血清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾，勿直接過濾血清,。（一般情況下不影響細(xì)胞培養(yǎng)）

瓶裝血清一定要逐步解凍: 4℃ 冰箱全溶后再分裝,，在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一,，減少沉淀的發(fā)生,。勿直接由 –20℃ 直接至 37℃ 解凍，因溫度改變太大,，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀,。

熱滅活是指 56℃，30 分鐘加熱已*解凍之血清,。水浴鍋升到 56℃后,，將血清放入，待溫度升高到 56℃ 后計(jì)時(shí),，一般 5 分鐘左右規(guī)則搖晃均勻一次,。此熱處理之目的是使血清中之補(bǔ)體成份去活化。除非必須,，一般不要作此熱處理,，因?yàn)闀?huì)造成沉淀物之顯著增多,，且會(huì)影響血清之品質(zhì),。注意更換新血清（包括不同批次）對(duì)細(xì)胞的影響。

7,、無菌意識(shí)要強(qiáng)

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前,，超凈臺(tái)以紫外燈照射 30 分鐘滅菌，以 70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面,，并開啟超凈工作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)數(shù)分鐘后,，才開始實(shí)驗(yàn)操作。

每次操作只處理一株細(xì)胞株，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染,。實(shí)驗(yàn)完畢后,，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，以 70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面,。

無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞,，必要物品，例如支架,、吸管等公用物品可以暫時(shí)放置,，其它個(gè)人實(shí)驗(yàn)用品用完應(yīng)立即拿出。實(shí)驗(yàn)用品以 70% 乙醇擦拭后才帶入無菌操作臺(tái)內(nèi),。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在中央無菌區(qū)域,，一般勿在邊緣區(qū)域操作。

小心取用無菌之實(shí)驗(yàn)物品,，避免造成污染,。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn),。容器打開后,，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約 45° 角取用,，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面,。

8、選擇正確的培養(yǎng)基 

不同的細(xì)胞可能培養(yǎng)基不同,，甚至不同的文獻(xiàn)可能對(duì)相同的細(xì)胞培養(yǎng)基成分也是可能不同的,。如我當(dāng)時(shí)培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，有文獻(xiàn)就選用 neurobase 培養(yǎng)基,，而我的實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹饕亲隹寡趸脱趸矫娴?，而這種培養(yǎng)基中含有抗氧化劑成分，此時(shí),，我就不得不選擇另外一種不含抗氧化劑的培養(yǎng)基,。