一、實(shí)驗(yàn)原理
細(xì)胞培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng),。直接從體內(nèi)獲取的組織細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)為原代培養(yǎng),；當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，則需要做再培養(yǎng),， 即將培養(yǎng)的細(xì)胞分散后,，從一個(gè)容器以1：2或其他比率轉(zhuǎn)移到另一個(gè)或幾個(gè)容器中擴(kuò)大培養(yǎng)，為傳代培養(yǎng),，傳代培養(yǎng)的累積次數(shù)就是細(xì)胞的代數(shù),。
細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力,。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或DMSO作保護(hù)劑,，這兩種物質(zhì)能提高 細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外,，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方 法,，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化,，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。
二,、實(shí)驗(yàn)方法
材料：
小鼠,，生理鹽水，100ml滅菌燒杯,，15ml離心管,，培養(yǎng)皿，滴管,，無(wú)菌鑷子,、剪刀，篩網(wǎng),，泡沫板,，大頭針，酒精燈,，培養(yǎng)瓶,，培養(yǎng) 液，PBS,，0.25%胰酶,，超凈工作臺(tái)、二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡,，顯微鏡，計(jì)數(shù)板,，離心機(jī),，恒溫水浴箱，冰箱（4℃,、-20℃,、-70℃），液氮 罐,，凍存管,，凍存液，廢液缸等,。
方法：
（1）原代培養(yǎng)：
1.取出小鼠后瀝干酒精,，放入超凈臺(tái)內(nèi)，固定在泡沫板上,。
2.用鑷子提起皮膚,，用解剖剪剪開(kāi)皮膚一個(gè)橫切口，將皮膚向上撕開(kāi),，然后剪開(kāi)肌肉等,，暴露出腹腔，在左側(cè)找到脾臟,，用彎頭眼科鑷取出脾臟,，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中。
3.用生理鹽水將取出的脾臟清洗多次,，并剔除多余無(wú)用的組織,。
4.將篩網(wǎng)置于平皿中，脾臟置于篩網(wǎng)上,，用彎頭鑷鑷住,，輕輕在篩網(wǎng)上進(jìn)行碾磨，同時(shí)不停滴加不含血清的培養(yǎng)液沖洗,。
5.將碾磨好的細(xì)胞懸液吸入至離心管中,，離心(1000rpm,5min)，吸去上清（去除血液等）,。
6.加入10ml培養(yǎng)液,，吹打混勻，取樣計(jì)數(shù),。
7.將稀釋好的細(xì)胞懸液分裝于培養(yǎng)瓶中,，輕輕搖晃混勻，在培養(yǎng)瓶上。
面做好標(biāo)志,，注明細(xì)胞,、組別及日期。然后將培養(yǎng)瓶置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。
（2）傳代培養(yǎng)：
1.倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),，確定細(xì)胞是否需要傳代。
2.培養(yǎng)液瓶打開(kāi)后,，過(guò)酒精燈火焰,，置酒精燈火焰周?chē)?/p>
3.拿出直頭滴管，套上橡皮吸頭,，過(guò)火,，放入培養(yǎng)液瓶中。
4.打開(kāi)培養(yǎng)瓶,，瓶口過(guò)火,，將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液輕輕倒入廢液缸，用2-3mLPBS洗去殘留的舊培養(yǎng)基,。
5.培養(yǎng)瓶加入0.25%胰酶,，用量以薄薄蓋滿一層為宜，37℃消化,，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞收回突起變圓時(shí)立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,，使細(xì)胞脫離胰酶，然后將胰酶倒掉,，加入少量的含血清的新鮮培養(yǎng)基,。
6.取彎頭滴管反復(fù)吹打細(xì)胞使其脫壁并分散，再根據(jù)分傳瓶數(shù)補(bǔ)加一定量的含血清的新鮮培養(yǎng)基,，制成細(xì)胞懸液,，然后分裝到新培養(yǎng)瓶中。蓋上瓶蓋,，適度擰緊后再稍回轉(zhuǎn),，以利于CO2氣體的進(jìn)入，將培養(yǎng)瓶放回CO2培養(yǎng)箱,。
7.對(duì)半貼壁培養(yǎng)細(xì)胞,，不需胰酶，直接吹打,，加入新鮮培養(yǎng)基,，然后分裝到各瓶中。
（3）凍存：
1.吸取傳代后的細(xì)胞懸液,，離心,，去除培養(yǎng)液,，加入凍存液，分裝凍存管（凍存管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為（5～10）×106個(gè)/ml,，2ml凍存管中一般放1～1.5ml細(xì)胞）,。
2.按步凍存
o冷凍保存方法一：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1～-2℃/min；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí),，可增至-5～-10℃/min,；到-100℃時(shí)，則可迅速浸入液氮中,。
o冷凍保存方法二：冷凍管置于已設(shè)定程序之程序降溫機(jī)中每分鐘降1～3℃至-80℃以下，再放入液氮長(zhǎng)期保存,。
（4）復(fù)蘇：
1.取出冷凍管,，立即放入37℃水浴箱中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化,，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi),。
2.打開(kāi)凍存管，將細(xì)胞懸液吸到離心管中,。
3.1000rpm離心10分鐘,，棄去上清液。
4.加適當(dāng)培養(yǎng)液后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中,，37℃培養(yǎng),，第二天觀察生長(zhǎng)情況。
三,、實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算
1.一只小鼠可獲得（1～2.5）×108個(gè)脾細(xì)胞,。
2.細(xì)胞接種后一般幾小時(shí)內(nèi)就能貼壁，并開(kāi)始生長(zhǎng),，如接種的細(xì)胞密度適宜,，5天到一周即可形成單層。
3.一般情況,，傳代后的細(xì)胞在2小時(shí)左右就能附著在培養(yǎng)瓶壁上,，2～4天就可在瓶?jī)?nèi)形成單層，需要再次進(jìn)行傳代,。
四,、注意事項(xiàng)
1.取材要求新鮮，無(wú)菌,，解剖小鼠時(shí),，注意不要損傷脾臟及其周?chē)呐K器，尤其是腸道等,，防止污染脾臟,。
2.沖洗脾臟時(shí)要盡量洗凈血污,，去除無(wú)用組織，并要防止組織干燥,。
3.碾磨后及時(shí)用清水沖洗篩網(wǎng),，防止組織、細(xì)胞阻塞網(wǎng)孔,。
4.計(jì)數(shù)前,，注意吸盡平皿里的細(xì)胞，充分混勻,，使細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞,。
5.實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在操作臺(tái)中央無(wú)菌區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，勿在邊緣非無(wú)菌區(qū)域操作,。
6.金屬器械不能在火焰中燒的時(shí)間過(guò)長(zhǎng),，燒過(guò)的金屬鑷要待冷卻后才能挾取組織，以免造成組織損傷,。
7.另外膠塞過(guò)火焰時(shí)也不能時(shí)間長(zhǎng),，以免燒焦產(chǎn)生有毒氣體，危害培養(yǎng)細(xì)胞,。
8.吸取過(guò)營(yíng)養(yǎng)液后的吸管不能再用火焰燒灼,，因殘留在吸管頭中營(yíng)養(yǎng)液能燒焦形成炭膜，再用時(shí)會(huì)把有害物帶入營(yíng)養(yǎng)液中,。
9.不能用手觸及已消毒器皿瓶口,、瓶塞內(nèi)部，吸管前部等所有可能與細(xì)胞接觸的部分,，如已接觸,，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。
10.開(kāi)啟,、關(guān)閉長(zhǎng)有細(xì)胞的培養(yǎng)瓶時(shí),，火焰滅菌時(shí)間要短。防止因溫度過(guò)高燒死細(xì)胞,。
11.換液時(shí)傾倒廢液,，瓶口不能接觸廢液缸，速度不能過(guò)快,，防止廢液四濺,。
12.吹打細(xì)胞時(shí)，要注意邊角的細(xì)胞是否吹打下來(lái),。
13.手或相對(duì)較臟的物品不能經(jīng)過(guò)開(kāi)放的瓶口上,，即不可以在開(kāi)放容器上方操作。
14.每次操作只處理一株細(xì)胞,，以免造成細(xì)胞交叉污染,。
15.注意自身的安全,，對(duì)于來(lái)自人源性或病毒感染的細(xì)胞株應(yīng)特別小心。操作過(guò)程中,，應(yīng)避免引起氣溶膠的產(chǎn)生,，小心有毒性試劑例如DMSO，并避免尖銳物品傷人等,。
16.從增殖期到形成致密的單層細(xì)胞以前的培養(yǎng)細(xì)胞都可以用于凍存,，但最好為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。在凍存前一天最好換一次培養(yǎng)液,。
17.將凍存管放入液氮容器或從中取出時(shí),，要做好防護(hù)工作，以免凍傷,。
18.凍存和復(fù)蘇最好用新配制的培養(yǎng)液,。
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