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NK細胞培養(yǎng)與優(yōu)化

閱讀:1594      發(fā)布時間:2021-5-21
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       因NK細胞是一種比較難培養(yǎng)的細胞,。培養(yǎng)過程會涉及很多問題,如:細胞接種密度如何,?NK細胞有哪些特性,?NK細胞具有哪些形態(tài)特征?......

       使用的NK細胞培養(yǎng)套裝為無飼養(yǎng)層細胞體外擴增技術(shù),,以外周血單個核細胞(PBMC)為起始種子細胞,,結(jié)合多種細胞因子的誘導(dǎo)和刺激,實現(xiàn)NK細胞體外特異性的高效擴增,。具有適用性強,,對種子細胞的來源選擇性好,不需包被,;無飼養(yǎng)層培養(yǎng)工藝,簡化操作,,提高產(chǎn)品安全性,;使用多種細胞因子及小分子物質(zhì)聯(lián)合刺激,充分活化效應(yīng)細胞等技術(shù)優(yōu)勢,。

       試劑:NK細胞培養(yǎng)套裝,;

       耗材:培養(yǎng)瓶;細胞培養(yǎng)袋,;移液管,;采血袋等。

       操作過程:

       D0:白細胞層分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)

       臍血經(jīng)病毒檢測合格后,,送入實驗室中,。取70ml臍血,按常規(guī)的血漿及PBMC分離方法分離獲得血漿和白細胞層,。白細胞層經(jīng)洗滌,,計數(shù)為7.4*107,以1.5*106個/ml密度接種在培養(yǎng)瓶中,。加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基,、因子及滅活血漿,放置在37℃,,5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。

 

       注意事項:

       1、臍血盡可能采集新鮮血液,,否則容易凝血,;

       2,、需注意Ficoll的溫度,否則易混雜較多紅細胞,;

       3,、注意離心的升降速設(shè)置,否則無法獲得白細胞層,。

?

       D2:顯微鏡下觀察細胞生長狀況:

       細胞經(jīng)誘導(dǎo)刺激,,有明顯的半貼壁聚團生長,部分細胞聚團懸浮生長,。細胞略有增殖,,增殖不明顯。

 

       20*物鏡

       D3:細胞觀察并補充誘導(dǎo)培養(yǎng)基

       細胞經(jīng)過二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng),,半懸浮貼壁較D2增多,,細胞聚團更為明顯。

       注意事項:前3天不能劇烈晃動細胞,,避免干擾細胞成團,。

 

       10*物鏡

       D5:細胞觀察并補充增殖培養(yǎng)基

       經(jīng)過兩天的培養(yǎng),半懸浮貼壁的細胞已開始懸浮于培養(yǎng)基中,,培養(yǎng)基顏色變黃,。細胞計數(shù)為1.1*106/ml,補充增殖培養(yǎng)基,,刺激NK細胞增殖,。

 

       10*物鏡

       D7:細胞觀察并補充增殖培養(yǎng)基

      培養(yǎng)基顏色變黃,顯微鏡下可明顯看到細胞聚團增大,。細胞計數(shù)為2.0*106/ml,,補充增殖培養(yǎng)基,調(diào)整細胞密度,,刺激NK細胞增殖,。細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)袋中培養(yǎng)。略微吹打細胞,,使細胞團略微分散,。輕晃培養(yǎng)袋,使細胞分散培養(yǎng),。

 

       10*物鏡

       D9:細胞觀察并補充增殖培養(yǎng)基

       培養(yǎng)袋中培養(yǎng)基變黃,,取細胞計數(shù)并將細胞放置在細菌皿中觀察形態(tài),發(fā)現(xiàn)細胞已基本分散生長,。細胞計數(shù)為1.5*106/ml,,補充培養(yǎng)基。

 

       10*物鏡

       D11:細胞觀察并補充增殖培養(yǎng)基

       培養(yǎng)袋中培養(yǎng)基變黃,取細胞計數(shù)并將細胞放置在二氧化碳培養(yǎng)箱中觀察形態(tài),,發(fā)現(xiàn)細胞已呈不規(guī)則形態(tài),,部分細胞有觸角伸出。細胞計數(shù)為1.7*106/ml,,補充培養(yǎng)基,。

 

       10*物鏡                                                            

 

       40*物鏡

       D12:細胞觀察并補充增殖培養(yǎng)基(本次非常規(guī)補液)

       培養(yǎng)袋中培養(yǎng)基變黃,取細胞計數(shù)并將細胞放置在細菌皿中觀察形態(tài),,細胞形態(tài)與D11基本類似,,取細胞進行流式細胞檢測。細胞計數(shù)為1.5*106/ml,,補充培養(yǎng)基,。

       流式細胞檢測:CD3-/CD16+CD56+為82.74%

 

       10*物鏡                                                            

 

       40*物鏡

 

 

 

       D12-NK細胞流式檢測結(jié)果

       D14:細胞檢測

       培養(yǎng)袋中培養(yǎng)基變黃,取細胞計數(shù)并將細胞放置在細菌皿中觀察形態(tài),,取細胞進行流式細胞檢測,。細胞計數(shù)為2.0*106/ml。

       流式細胞檢測:CD3-/CD16+CD56+為90.98%

 

       10*物鏡                                                          

 

       40*物鏡

 

       D14-NK細胞流式檢測結(jié)果

 

       (一)X-VIVO無血清造血細胞培養(yǎng)基

 

       這個系列是屬于化學(xué)成分限定培養(yǎng)基,,為包括淋巴因子激活殺傷細胞(LAK),、外周血淋巴細胞(PBL)和腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)在內(nèi)的多種細胞提供營養(yǎng)完整和平衡的環(huán)境。此類培養(yǎng)基不包含任何外源性生長因子,、人工促進細胞增殖的物質(zhì)或未定義的補充物,。它們不含任何蛋白激酶C刺激因子,適用于研究人類和小鼠淋巴細胞激活中的第二信使系統(tǒng),。

 

      如需了解更多技術(shù)知識,歡迎聯(lián)系上海喆圖科學(xué)儀器有限公司,。

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