因NK細(xì)胞是一種比較難培養(yǎng)的細(xì)胞,。培養(yǎng)過(guò)程會(huì)涉及很多問(wèn)題,，如：細(xì)胞接種密度如何？NK細(xì)胞有哪些特性,？NK細(xì)胞具有哪些形態(tài)特征,？......
使用的NK細(xì)胞培養(yǎng)套裝為無(wú)飼養(yǎng)層細(xì)胞體外擴(kuò)增技術(shù)，以外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）為起始種子細(xì)胞,，結(jié)合多種細(xì)胞因子的誘導(dǎo)和刺激,，實(shí)現(xiàn)NK細(xì)胞體外特異性的高效擴(kuò)增。具有適用性強(qiáng),，對(duì)種子細(xì)胞的來(lái)源選擇性好,，不需包被；無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)工藝,，簡(jiǎn)化操作,，提高產(chǎn)品安全性；使用多種細(xì)胞因子及小分子物質(zhì)聯(lián)合刺激,，充分活化效應(yīng)細(xì)胞等技術(shù)優(yōu)勢(shì),。
試劑：NK細(xì)胞培養(yǎng)套裝；
耗材：培養(yǎng)瓶,；細(xì)胞培養(yǎng)袋,；移液管；采血袋等,。
操作過(guò)程：
D0：白細(xì)胞層分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)
臍血經(jīng)病毒檢測(cè)合格后,，送入實(shí)驗(yàn)室中。取70ml臍血,，按常規(guī)的血漿及PBMC分離方法分離獲得血漿和白細(xì)胞層,。白細(xì)胞層經(jīng)洗滌，計(jì)數(shù)為7.4*107,，以1.5*106個(gè)/ml密度接種在培養(yǎng)瓶中,。加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基、因子及滅活血漿,，放置在37℃,，5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
注意事項(xiàng)：
1,、臍血盡可能采集新鮮血液,，否則容易凝血；
2,、需注意Ficoll的溫度,，否則易混雜較多紅細(xì)胞；
3,、注意離心的升降速設(shè)置,，否則無(wú)法獲得白細(xì)胞層,。
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D2：顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況：
細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)刺激，有明顯的半貼壁聚團(tuán)生長(zhǎng),，部分細(xì)胞聚團(tuán)懸浮生長(zhǎng),。細(xì)胞略有增殖，增殖不明顯,。
20*物鏡
D3：細(xì)胞觀察并補(bǔ)充誘導(dǎo)培養(yǎng)基
細(xì)胞經(jīng)過(guò)二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng),，半懸浮貼壁較D2增多，細(xì)胞聚團(tuán)更為明顯,。
注意事項(xiàng)：前3天不能劇烈晃動(dòng)細(xì)胞,，避免干擾細(xì)胞成團(tuán)。
10*物鏡
D5：細(xì)胞觀察并補(bǔ)充增殖培養(yǎng)基
經(jīng)過(guò)兩天的培養(yǎng),，半懸浮貼壁的細(xì)胞已開(kāi)始懸浮于培養(yǎng)基中,，培養(yǎng)基顏色變黃。細(xì)胞計(jì)數(shù)為1.1*106/ml,，補(bǔ)充增殖培養(yǎng)基,，刺激NK細(xì)胞增殖。
10*物鏡
D7：細(xì)胞觀察并補(bǔ)充增殖培養(yǎng)基
培養(yǎng)基顏色變黃,，顯微鏡下可明顯看到細(xì)胞聚團(tuán)增大,。細(xì)胞計(jì)數(shù)為2.0*106/ml，補(bǔ)充增殖培養(yǎng)基,，調(diào)整細(xì)胞密度，刺激NK細(xì)胞增殖,。細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)袋中培養(yǎng),。略微吹打細(xì)胞，使細(xì)胞團(tuán)略微分散,。輕晃培養(yǎng)袋,，使細(xì)胞分散培養(yǎng)。
10*物鏡
D9：細(xì)胞觀察并補(bǔ)充增殖培養(yǎng)基
培養(yǎng)袋中培養(yǎng)基變黃,，取細(xì)胞計(jì)數(shù)并將細(xì)胞放置在細(xì)菌皿中觀察形態(tài),，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞已基本分散生長(zhǎng)。細(xì)胞計(jì)數(shù)為1.5*106/ml,，補(bǔ)充培養(yǎng)基,。
10*物鏡
D11：細(xì)胞觀察并補(bǔ)充增殖培養(yǎng)基
培養(yǎng)袋中培養(yǎng)基變黃，取細(xì)胞計(jì)數(shù)并將細(xì)胞放置在二氧化碳培養(yǎng)箱中觀察形態(tài),，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞已呈不規(guī)則形態(tài),，部分細(xì)胞有觸角伸出。細(xì)胞計(jì)數(shù)為1.7*106/ml,，補(bǔ)充培養(yǎng)基,。
10*物鏡
40*物鏡
D12：細(xì)胞觀察并補(bǔ)充增殖培養(yǎng)基（本次非常規(guī)補(bǔ)液）
培養(yǎng)袋中培養(yǎng)基變黃,，取細(xì)胞計(jì)數(shù)并將細(xì)胞放置在細(xì)菌皿中觀察形態(tài)，細(xì)胞形態(tài)與D11基本類似,，取細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè),。細(xì)胞計(jì)數(shù)為1.5*106/ml，補(bǔ)充培養(yǎng)基,。
流式細(xì)胞檢測(cè)：CD3-/CD16+CD56+為82.74%
10*物鏡
40*物鏡
D12-NK細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果
D14：細(xì)胞檢測(cè)
培養(yǎng)袋中培養(yǎng)基變黃,，取細(xì)胞計(jì)數(shù)并將細(xì)胞放置在細(xì)菌皿中觀察形態(tài)，取細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè),。細(xì)胞計(jì)數(shù)為2.0*106/ml,。
流式細(xì)胞檢測(cè)：CD3-/CD16+CD56+為90.98%
10*物鏡
40*物鏡
D14-NK細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果
(一)X-VIVO無(wú)血清造血細(xì)胞培養(yǎng)基
這個(gè)系列是屬于化學(xué)成分限定培養(yǎng)基，為包括淋巴因子激活殺傷細(xì)胞(LAK),、外周血淋巴細(xì)胞(PBL)和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)在內(nèi)的多種細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)完整和平衡的環(huán)境,。此類培養(yǎng)基不包含任何外源性生長(zhǎng)因子、人工促進(jìn)細(xì)胞增殖的物質(zhì)或未定義的補(bǔ)充物,。它們不含任何蛋白激酶C刺激因子,，適用于研究人類和小鼠淋巴細(xì)胞激活中的第二信使系統(tǒng)。
如需了解更多技術(shù)知識(shí),，歡迎聯(lián)系上海喆圖科學(xué)儀器有限公司,。
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