因NK細胞是一種比較難培養(yǎng)的細胞,。培養(yǎng)過程會涉及很多問題,，如：細胞接種密度如何,？NK細胞有哪些特性,？NK細胞具有哪些形態(tài)特征？......
使用的NK細胞培養(yǎng)套裝為無飼養(yǎng)層細胞體外擴增技術,，以外周血單個核細胞（PBMC）為起始種子細胞,，結合多種細胞因子的誘導和刺激，實現(xiàn)NK細胞體外特異性的高效擴增,。具有適用性強,，對種子細胞的來源選擇性好，不需包被,；無飼養(yǎng)層培養(yǎng)工藝,，簡化操作，提高產(chǎn)品安全性,；使用多種細胞因子及小分子物質聯(lián)合刺激,，充分活化效應細胞等技術優(yōu)勢。
試劑：NK細胞培養(yǎng)套裝,；
耗材：培養(yǎng)瓶,；細胞培養(yǎng)袋；移液管,；采血袋等,。
操作過程：
D0：白細胞層分離培養(yǎng)及誘導
臍血經(jīng)病毒檢測合格后，送入實驗室中,。取70ml臍血,，按常規(guī)的血漿及PBMC分離方法分離獲得血漿和白細胞層。白細胞層經(jīng)洗滌,，計數(shù)為7.4*107,，以1.5*106個/ml密度接種在培養(yǎng)瓶中。加入誘導培養(yǎng)基、因子及滅活血漿,，放置在37℃,，5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
注意事項：
1,、臍血盡可能采集新鮮血液,，否則容易凝血；
2,、需注意Ficoll的溫度,，否則易混雜較多紅細胞；
3,、注意離心的升降速設置,，否則無法獲得白細胞層。
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D2：顯微鏡下觀察細胞生長狀況：
細胞經(jīng)誘導刺激,，有明顯的半貼壁聚團生長,，部分細胞聚團懸浮生長。細胞略有增殖,，增殖不明顯,。
20*物鏡
D3：細胞觀察并補充誘導培養(yǎng)基
細胞經(jīng)過二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，半懸浮貼壁較D2增多,，細胞聚團更為明顯,。
注意事項：前3天不能劇烈晃動細胞，避免干擾細胞成團,。
10*物鏡
D5：細胞觀察并補充增殖培養(yǎng)基
經(jīng)過兩天的培養(yǎng),，半懸浮貼壁的細胞已開始懸浮于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基顏色變黃,。細胞計數(shù)為1.1*106/ml,，補充增殖培養(yǎng)基，刺激NK細胞增殖,。
10*物鏡
D7：細胞觀察并補充增殖培養(yǎng)基
培養(yǎng)基顏色變黃,，顯微鏡下可明顯看到細胞聚團增大。細胞計數(shù)為2.0*106/ml,，補充增殖培養(yǎng)基,，調整細胞密度，刺激NK細胞增殖,。細胞轉移至培養(yǎng)袋中培養(yǎng),。略微吹打細胞，使細胞團略微分散,。輕晃培養(yǎng)袋,，使細胞分散培養(yǎng),。
10*物鏡
D9：細胞觀察并補充增殖培養(yǎng)基
培養(yǎng)袋中培養(yǎng)基變黃，取細胞計數(shù)并將細胞放置在細菌皿中觀察形態(tài),，發(fā)現(xiàn)細胞已基本分散生長,。細胞計數(shù)為1.5*106/ml，補充培養(yǎng)基,。
10*物鏡
D11：細胞觀察并補充增殖培養(yǎng)基
培養(yǎng)袋中培養(yǎng)基變黃,，取細胞計數(shù)并將細胞放置在二氧化碳培養(yǎng)箱中觀察形態(tài)，發(fā)現(xiàn)細胞已呈不規(guī)則形態(tài),，部分細胞有觸角伸出,。細胞計數(shù)為1.7*106/ml，補充培養(yǎng)基,。
10*物鏡
40*物鏡
D12：細胞觀察并補充增殖培養(yǎng)基（本次非常規(guī)補液）
培養(yǎng)袋中培養(yǎng)基變黃,，取細胞計數(shù)并將細胞放置在細菌皿中觀察形態(tài)，細胞形態(tài)與D11基本類似,，取細胞進行流式細胞檢測,。細胞計數(shù)為1.5*106/ml，補充培養(yǎng)基,。
流式細胞檢測：CD3-/CD16+CD56+為82.74%
10*物鏡
40*物鏡
D12-NK細胞流式檢測結果
D14：細胞檢測
培養(yǎng)袋中培養(yǎng)基變黃,，取細胞計數(shù)并將細胞放置在細菌皿中觀察形態(tài),，取細胞進行流式細胞檢測,。細胞計數(shù)為2.0*106/ml。
流式細胞檢測：CD3-/CD16+CD56+為90.98%
10*物鏡
40*物鏡
D14-NK細胞流式檢測結果
(一)X-VIVO無血清造血細胞培養(yǎng)基
這個系列是屬于化學成分限定培養(yǎng)基,，為包括淋巴因子激活殺傷細胞(LAK),、外周血淋巴細胞(PBL)和腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)在內的多種細胞提供營養(yǎng)完整和平衡的環(huán)境。此類培養(yǎng)基不包含任何外源性生長因子,、人工促進細胞增殖的物質或未定義的補充物,。它們不含任何蛋白激酶C刺激因子，適用于研究人類和小鼠淋巴細胞激活中的第二信使系統(tǒng),。
如需了解更多技術知識,，歡迎聯(lián)系上海喆圖科學儀器有限公司。
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