核心提示:大多數(shù)細菌均可以通過人工方法培養(yǎng),,只有將微生物培養(yǎng)出來才能對它進行研究、鑒定和應(yīng)用,。
接種與分離方法
根據(jù)待檢標本的性質(zhì),、培養(yǎng)目的和所用培養(yǎng)基的種類,采用不同的接種方法,。
1.平板劃線分離培養(yǎng)法
對混有多種細菌,,采用劃線分離和培養(yǎng),使原來混雜在一起的細菌沿劃線在瓊脂平板表面分離,,得到分散的單個菌落,,以獲得純種。平板劃線分離法通常有兩種方法:
①分區(qū)劃線分離法:此法常用于含菌量較多的細菌的分離,。先用接種環(huán)挑取標本涂布于瓊脂平板1區(qū)(占培養(yǎng)基總面積的¼)并作數(shù)條劃線,,再于2、3,、4區(qū)依次劃線,。每劃完一個區(qū)域,均將接種環(huán)燒灼滅菌1次,,冷后再劃下一區(qū)域,,每一區(qū)域的劃線均與上一區(qū)域的劃線交接1~3次。一個成功分區(qū)劃線的平板,,培養(yǎng)后分別觀察1區(qū)形成菌苔,,2區(qū)菌落連成線,3區(qū)和4區(qū)可分離到單個菌落,。
②連續(xù)劃線分離法:此法常用于含菌量不多的標本或培養(yǎng)物中的細菌分離培養(yǎng),。方法是先將接種物在瓊脂平板上1/5處輕輕涂抹,然后再用接種環(huán)或拭子在平板表面曲線連續(xù)劃線接種,,直至劃滿瓊脂平板表面,。
2.瓊脂斜面接種法
主要用于菌落的移種,以獲得純種進行鑒定和保存菌種等,。用接種環(huán)(針)挑取單個菌落或培養(yǎng)物,,從培養(yǎng)基斜面底部向上劃一條直線,,然后再從底部沿直線向上曲折連續(xù)劃線,直至斜面近頂端處止,。生化鑒定培養(yǎng)基斜面接種,,用接種針挑取待鑒定細菌的菌落,從斜面中央垂直刺入底部,,抽出后在斜面上由下至上曲折劃線接種,。
3.穿刺接種法
此法多用于半固體培養(yǎng)基或雙糖鐵、明膠等具有高層的培養(yǎng)基接種,,半固體培養(yǎng)基的穿刺接種可用于觀察細菌的動力,。接種時用接種針挑取菌落,由培養(yǎng)基中央垂直刺入至距管底0.4cm處,,再沿穿刺線退出接種針,。雙糖鐵等有高層及斜面之分的培養(yǎng)基,穿刺高層部分,,退出接種針后直接劃線接種斜面部分,。
4.液體培養(yǎng)基接種法
用于各種液體培養(yǎng)基如肉湯、蛋白胨水,、糖發(fā)酵管等的接種,。用接種環(huán)挑取單個菌落,傾斜液體培養(yǎng)管,,在液面與管壁交界處研磨接種物(以試管直立后液體淹沒接種物為準),。此接種法應(yīng)避免接種環(huán)與液體過多接觸,更不應(yīng)在液體中混勻,、攪拌,,以免形成氣溶膠,造成實驗室污染,。
5.傾注平板法
本法主要用于飲水,、飲料、牛乳等標本中的細菌計數(shù),。取純培養(yǎng)物的稀釋或原標本1ml至無菌培養(yǎng)皿內(nèi),,再將已融化并冷卻至45~50℃左右的瓊脂培養(yǎng)基15~20ml傾注入該無菌培養(yǎng)皿內(nèi),混勻,,待凝固后置37℃培養(yǎng)箱 培養(yǎng),,長出菌落后進行菌落計數(shù),以求出每毫升標本中所含菌數(shù),。先數(shù)6個方格(每格為1cm2)中菌落數(shù),,求出每格的平均菌落數(shù),并算出平皿直徑,,然后按下列公式計數(shù),,求出每毫升標本中的細菌數(shù),。
全平板菌落數(shù)=每方格的平均菌落數(shù)×лr2
每ml標本中的細菌數(shù)=全平板菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)
6.涂布接種法
本法多用于紙片擴散法藥敏試驗的細菌接種。將一定量或適量的菌液加到瓊脂培養(yǎng)基表面,,然后用滅菌的L型玻璃棒或棉拭子于不同的角度反復涂布,,使被接種液均勻分布于瓊脂表面,然后貼上藥敏紙片,,或直接培養(yǎng),,本法經(jīng)培養(yǎng)后細菌形成菌苔。
細菌的培養(yǎng)方法
根據(jù)不同的標本及不同的培養(yǎng)目的,,可選用不同的培養(yǎng)方法,。通常把細菌的培養(yǎng)方法分為需氧培養(yǎng)、二氧化碳培養(yǎng),、微需氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)四種。
1.需氧培養(yǎng)
是指需氧菌或兼性厭氧菌在有氧條件下的培養(yǎng),,將已接種好的平板,、斜面、液體培養(yǎng)基等在空氣中置35℃孵育箱內(nèi)孵育18~24h,,無特殊要求的細菌均可生長,。少數(shù)生長緩慢的細菌需要培養(yǎng)3-7d甚至1個月才能生長。為使孵育箱內(nèi)保持一定的濕度,,可在其內(nèi)放置一杯水,。對培養(yǎng)時間較長的培養(yǎng)基,接種后應(yīng)將試管口塞好棉塞或硅膠塞后用石蠟-凡士林封固,,以防培養(yǎng)基干裂,。
2.二氧化碳培養(yǎng)
某些細菌,在初次分離時,,須在5%~10%二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng)才能生長,。常用的培養(yǎng)法如下。
①二氧化碳培養(yǎng)箱法:二氧化碳孵箱能自動調(diào)節(jié)二氧化碳的含量,、溫度和濕度,,培養(yǎng)物置于孵育箱內(nèi)閣,孵育一定時間后可直接觀察生長結(jié)果,。
②燭缸培養(yǎng)法:取有蓋磨口標本缸或玻璃干燥器,,將接種好的培養(yǎng)基放入缸內(nèi),點燃蠟燭后放在缸內(nèi)稍高于培養(yǎng)物的位置上,,缸蓋或缸口均涂以凡士林,,加蓋密閉。因缸內(nèi)蠟燭燃燒氧逐漸減少,,數(shù)分鐘后蠟燭自行熄滅,,此時容器內(nèi)二氧化碳含量約占5%~10%,。將缸置于35℃普通孵育箱內(nèi)孵育。
③氣袋法:選用無毒透明的塑料袋,,將已接種標本的培養(yǎng)皿放入袋內(nèi),,盡量祛除袋內(nèi)空氣后將開口處折疊并用彈簧夾夾緊袋口。使袋呈密閉狀態(tài),,執(zhí)斷袋內(nèi)已置的二氧化碳產(chǎn)氣管(安瓿)產(chǎn)生二氧化碳,,數(shù)分鐘內(nèi)就可達到需要的二氧化碳培養(yǎng)環(huán)境,置于35℃孵育箱內(nèi)孵育,。
④化學法:常用碳酸氫鈉-鹽酸法,。按每升容積稱取碳酸氫鈉0.4g與濃鹽酸0.35ml比例,分別置容器內(nèi),,連同容器置于玻璃缸內(nèi),,蓋緊密封,傾斜缸位使鹽酸與碳酸氫鈉接觸而生成二氧化碳,。于35℃孵育箱內(nèi)孵育,。
3.微需氧培養(yǎng)
微需氧菌培養(yǎng)在大氣中及無氧環(huán)境中均不能生長,在含有5%-6% 氧氣,,5%-10%二氧化碳和85%氮氣的氣體環(huán)境中才可生長,,將標本接種到培養(yǎng)基上,置于上述氣體環(huán)境中,,35℃進行培養(yǎng)即微需氧培養(yǎng)法,。
4.厭氧培養(yǎng)
厭氧菌對氧敏感,培養(yǎng)過程中需造成低氧化還原電勢的厭氧環(huán)境,。厭氧培養(yǎng)常用的方法有:物理法,、化學法、生物法,。如厭氧罐培養(yǎng)法,、氣袋法、厭氧手套箱法,、需氧菌共生厭氧法等,。
細菌在培養(yǎng)基上生長特性
1.固體培養(yǎng)基標本或液體培養(yǎng)物劃線接種到固體培養(yǎng)基表面后,單個細菌經(jīng)分裂繁殖可形成一個肉眼可見的細菌集團,,稱為菌落(colony),。
①菌落的形態(tài)特征:大小、形狀(露滴狀,、圓形,、菜花樣、不規(guī)則等)、突起或扁平,、凹陷,、邊緣(光滑、波形,、鋸齒狀,、卷發(fā)狀等)、顏色(紅色,、灰白色,、黑色、綠色,、無色,、黃色等)、表面(光滑,、粗糙等),、透明度(不透明、半透明,、透明等)和粘度等,。據(jù)細菌菌落表面特征不同,可將菌落分為3型:
A.光滑型菌落(S型菌落):菌落表面光滑,、濕潤、邊緣整齊,,新分離的細菌大多呈光滑型菌落,。
B.粗糙型菌落(R型菌落):菌落表面粗糙、干燥,、呈皺紋或顆粒狀,,邊緣大多不整齊。R型菌落多為S型細菌變異失去菌體表面多糖或蛋白質(zhì)形成,。R型細菌抗原不完整,,毒力和抗吞噬能力都比S型細菌弱。但也有少數(shù)細菌新分離的毒力株就是R型,,如炭疽孢桿菌,、結(jié)核分枝菌等。
C.粘液型菌落(M型菌落):菌落粘稠,、有光澤,、似水珠樣。多見于厚莢膜或豐富粘液層的細菌,、結(jié)核桿菌等,。
②菌落溶血特征:菌落溶血有下列3種情況。
α溶血:又稱草綠色溶血,菌落周圍培養(yǎng)基出現(xiàn)1~2mm的草綠色環(huán),,為高鐵血紅蛋白所致,;
β溶血:又稱*溶血,菌落周圍形成一個*清晰透明的溶血環(huán),,是細菌產(chǎn)生的溶血素使紅細胞*溶解所致,;
γ溶血:即不溶血,菌落周圍的培養(yǎng)基沒有變化,,紅細胞沒有溶解或缺損,。
③色素:有些細菌產(chǎn)生水溶性色素,使菌落和周圍的培養(yǎng)基出現(xiàn)綠色,、金黃色,、白色、橙色,、檸檬色等顏色,,產(chǎn)生的色素有水溶性或脂溶性。
④氣味:某些細菌在培養(yǎng)基中生長繁殖后可產(chǎn)生特殊氣味,,如銅綠假單胞菌(生姜氣味),、變形桿菌(巧克力燒焦的臭味)、厭氧梭菌(惡臭味),、白色假絲酵母菌(酵母味)和放線菌(泥土味)等,。
2.液體培養(yǎng)基細菌在液體培養(yǎng)基中有3種生長現(xiàn)象:大多數(shù)細菌在液體培養(yǎng)基生長繁殖后呈均勻混濁;少數(shù)鏈狀排列的細菌如鏈球菌,、炭疽芽胞桿菌等則呈沉淀生長,;枯草芽胞桿菌、結(jié)核分枝桿菌和銅綠假單胞菌等專性需氧菌一般呈表面生長,,常形成菌膜,。
3.半固體培養(yǎng)基
半固體培養(yǎng)基主要用于細菌動力試驗,有鞭毛的細菌除了沿穿刺線生長外,,在穿刺線兩側(cè)也可見羽毛狀或云霧狀混濁生長,。無鞭毛的細菌只能沿穿刺線呈明顯的線狀生長,穿刺線兩邊的培養(yǎng)基仍然澄清透明,,為動力試驗陰性,。
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