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微生物的培養(yǎng)與分離方法

閱讀:2828      發(fā)布時(shí)間:2020-10-28
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       核心提示:大多數(shù)細(xì)菌均可以通過(guò)人工方法培養(yǎng),,只有將微生物培養(yǎng)出來(lái)才能對(duì)它進(jìn)行研究、鑒定和應(yīng)用,。

接種與分離方法

根據(jù)待檢標(biāo)本的性質(zhì),、培養(yǎng)目的和所用培養(yǎng)基的種類,采用不同的接種方法,。

       1.平板劃線分離培養(yǎng)法

對(duì)混有多種細(xì)菌,,采用劃線分離和培養(yǎng),使原來(lái)混雜在一起的細(xì)菌沿劃線在瓊脂平板表面分離,,得到分散的單個(gè)菌落,以獲得純種,。平板劃線分離法通常有兩種方法:

①分區(qū)劃線分離法:此法常用于含菌量較多的細(xì)菌的分離,。先用接種環(huán)挑取標(biāo)本涂布于瓊脂平板1區(qū)(占培養(yǎng)基總面積的¼)并作數(shù)條劃線,再于2,、3,、4區(qū)依次劃線。每劃完一個(gè)區(qū)域,,均將接種環(huán)燒灼滅菌1次,,冷后再劃下一區(qū)域,每一區(qū)域的劃線均與上一區(qū)域的劃線交接1~3次,。一個(gè)成功分區(qū)劃線的平板,,培養(yǎng)后分別觀察1區(qū)形成菌苔,,2區(qū)菌落連成線,3區(qū)和4區(qū)可分離到單個(gè)菌落,。

②連續(xù)劃線分離法:此法常用于含菌量不多的標(biāo)本或培養(yǎng)物中的細(xì)菌分離培養(yǎng),。方法是先將接種物在瓊脂平板上1/5處輕輕涂抹,然后再用接種環(huán)或拭子在平板表面曲線連續(xù)劃線接種,,直至劃滿瓊脂平板表面,。

       2.瓊脂斜面接種法

主要用于菌落的移種,以獲得純種進(jìn)行鑒定和保存菌種等,。用接種環(huán)(針)挑取單個(gè)菌落或培養(yǎng)物,,從培養(yǎng)基斜面底部向上劃一條直線,然后再?gòu)牡撞垦刂本€向上曲折連續(xù)劃線,,直至斜面近頂端處止,。生化鑒定培養(yǎng)基斜面接種,用接種針挑取待鑒定細(xì)菌的菌落,,從斜面中央垂直刺入底部,,抽出后在斜面上由下至上曲折劃線接種。

       3.穿刺接種法

此法多用于半固體培養(yǎng)基或雙糖鐵,、明膠等具有高層的培養(yǎng)基接種,,半固體培養(yǎng)基的穿刺接種可用于觀察細(xì)菌的動(dòng)力。接種時(shí)用接種針挑取菌落,,由培養(yǎng)基中央垂直刺入至距管底0.4cm處,,再沿穿刺線退出接種針。雙糖鐵等有高層及斜面之分的培養(yǎng)基,,穿刺高層部分,,退出接種針后直接劃線接種斜面部分。

       4.液體培養(yǎng)基接種法

用于各種液體培養(yǎng)基如肉湯,、蛋白胨水,、糖發(fā)酵管等的接種。用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落,,傾斜液體培養(yǎng)管,,在液面與管壁交界處研磨接種物(以試管直立后液體淹沒(méi)接種物為準(zhǔn))。此接種法應(yīng)避免接種環(huán)與液體過(guò)多接觸,,更不應(yīng)在液體中混勻,、攪拌,以免形成氣溶膠,,造成實(shí)驗(yàn)室污染,。

       5.傾注平板法

本法主要用于飲水、飲料,、牛乳等標(biāo)本中的細(xì)菌計(jì)數(shù),。取純培養(yǎng)物的稀釋或原標(biāo)本1ml至無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi),,再將已融化并冷卻至45~50℃左右的瓊脂培養(yǎng)基15~20ml傾注入該無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi),混勻,,待凝固后置37℃培養(yǎng)箱 培養(yǎng),,長(zhǎng)出菌落后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),以求出每毫升標(biāo)本中所含菌數(shù),。先數(shù)6個(gè)方格(每格為1cm2)中菌落數(shù),,求出每格的平均菌落數(shù),并算出平皿直徑,,然后按下列公式計(jì)數(shù),,求出每毫升標(biāo)本中的細(xì)菌數(shù)。

全平板菌落數(shù)=每方格的平均菌落數(shù)×лr2

每ml標(biāo)本中的細(xì)菌數(shù)=全平板菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)

       6.涂布接種法

本法多用于紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)的細(xì)菌接種,。將一定量或適量的菌液加到瓊脂培養(yǎng)基表面,,然后用滅菌的L型玻璃棒或棉拭子于不同的角度反復(fù)涂布,使被接種液均勻分布于瓊脂表面,,然后貼上藥敏紙片,,或直接培養(yǎng),本法經(jīng)培養(yǎng)后細(xì)菌形成菌苔,。

細(xì)菌的培養(yǎng)方法

根據(jù)不同的標(biāo)本及不同的培養(yǎng)目的,,可選用不同的培養(yǎng)方法。通常把細(xì)菌的培養(yǎng)方法分為需氧培養(yǎng),、二氧化碳培養(yǎng),、微需氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)四種。

       1.需氧培養(yǎng)

是指需氧菌或兼性厭氧菌在有氧條件下的培養(yǎng),,將已接種好的平板,、斜面、液體培養(yǎng)基等在空氣中置35℃孵育箱內(nèi)孵育18~24h,,無(wú)特殊要求的細(xì)菌均可生長(zhǎng),。少數(shù)生長(zhǎng)緩慢的細(xì)菌需要培養(yǎng)3-7d甚至1個(gè)月才能生長(zhǎng)。為使孵育箱內(nèi)保持一定的濕度,,可在其內(nèi)放置一杯水,。對(duì)培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)的培養(yǎng)基,接種后應(yīng)將試管口塞好棉塞或硅膠塞后用石蠟-凡士林封固,,以防培養(yǎng)基干裂,。

       2.二氧化碳培養(yǎng)

某些細(xì)菌,,在初次分離時(shí),,須在5%~10%二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng)才能生長(zhǎng)。常用的培養(yǎng)法如下,。

①二氧化碳培養(yǎng)箱法:二氧化碳孵箱能自動(dòng)調(diào)節(jié)二氧化碳的含量,、溫度和濕度,,培養(yǎng)物置于孵育箱內(nèi)閣,孵育一定時(shí)間后可直接觀察生長(zhǎng)結(jié)果,。

②燭缸培養(yǎng)法:取有蓋磨口標(biāo)本缸或玻璃干燥器,,將接種好的培養(yǎng)基放入缸內(nèi),點(diǎn)燃蠟燭后放在缸內(nèi)稍高于培養(yǎng)物的位置上,,缸蓋或缸口均涂以凡士林,,加蓋密閉。因缸內(nèi)蠟燭燃燒氧逐漸減少,,數(shù)分鐘后蠟燭自行熄滅,,此時(shí)容器內(nèi)二氧化碳含量約占5%~10%。將缸置于35℃普通孵育箱內(nèi)孵育,。

③氣袋法:選用無(wú)毒透明的塑料袋,,將已接種標(biāo)本的培養(yǎng)皿放入袋內(nèi),盡量祛除袋內(nèi)空氣后將開口處折疊并用彈簧夾夾緊袋口,。使袋呈密閉狀態(tài),,執(zhí)斷袋內(nèi)已置的二氧化碳產(chǎn)氣管(安瓿)產(chǎn)生二氧化碳,數(shù)分鐘內(nèi)就可達(dá)到需要的二氧化碳培養(yǎng)環(huán)境,,置于35℃孵育箱內(nèi)孵育,。

④化學(xué)法:常用碳酸氫鈉-鹽酸法。按每升容積稱取碳酸氫鈉0.4g與濃鹽酸0.35ml比例,,分別置容器內(nèi),,連同容器置于玻璃缸內(nèi),蓋緊密封,,傾斜缸位使鹽酸與碳酸氫鈉接觸而生成二氧化碳,。于35℃孵育箱內(nèi)孵育。

       3.微需氧培養(yǎng)

微需氧菌培養(yǎng)在大氣中及無(wú)氧環(huán)境中均不能生長(zhǎng),,在含有5%-6% 氧氣,,5%-10%二氧化碳和85%氮?dú)獾臍怏w環(huán)境中才可生長(zhǎng),將標(biāo)本接種到培養(yǎng)基上,,置于上述氣體環(huán)境中,,35℃進(jìn)行培養(yǎng)即微需氧培養(yǎng)法。

       4.厭氧培養(yǎng)

厭氧菌對(duì)氧敏感,,培養(yǎng)過(guò)程中需造成低氧化還原電勢(shì)的厭氧環(huán)境,。厭氧培養(yǎng)常用的方法有:物理法、化學(xué)法,、生物法,。如厭氧罐培養(yǎng)法、氣袋法、厭氧手套箱法,、需氧菌共生厭氧法等,。

細(xì)菌在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)特性

       1.固體培養(yǎng)基標(biāo)本或液體培養(yǎng)物劃線接種到固體培養(yǎng)基表面后,單個(gè)細(xì)菌經(jīng)分裂繁殖可形成一個(gè)肉眼可見的細(xì)菌集團(tuán),,稱為菌落(colony),。

①菌落的形態(tài)特征:大小、形狀(露滴狀,、圓形,、菜花樣、不規(guī)則等),、突起或扁平,、凹陷、邊緣(光滑,、波形,、鋸齒狀、卷發(fā)狀等),、顏色(紅色,、灰白色、黑色,、綠色,、無(wú)色、黃色等),、表面(光滑,、粗糙等)、透明度(不透明,、半透明,、透明等)和粘度等。據(jù)細(xì)菌菌落表面特征不同,,可將菌落分為3型:

A.光滑型菌落(S型菌落):菌落表面光滑,、濕潤(rùn)、邊緣整齊,,新分離的細(xì)菌大多呈光滑型菌落,。

B.粗糙型菌落(R型菌落):菌落表面粗糙、干燥,、呈皺紋或顆粒狀,,邊緣大多不整齊。R型菌落多為S型細(xì)菌變異失去菌體表面多糖或蛋白質(zhì)形成,。R型細(xì)菌抗原不完整,,毒力和抗吞噬能力都比S型細(xì)菌弱,。但也有少數(shù)細(xì)菌新分離的毒力株就是R型,如炭疽孢桿菌,、結(jié)核分枝菌等。

C.粘液型菌落(M型菌落):菌落粘稠,、有光澤,、似水珠樣。多見于厚莢膜或豐富粘液層的細(xì)菌,、結(jié)核桿菌等,。

②菌落溶血特征:菌落溶血有下列3種情況。

α溶血:又稱草綠色溶血,,菌落周圍培養(yǎng)基出現(xiàn)1~2mm的草綠色環(huán),,為高鐵血紅蛋白所致;

β溶血:又稱*溶血,,菌落周圍形成一個(gè)*清晰透明的溶血環(huán),,是細(xì)菌產(chǎn)生的溶血素使紅細(xì)胞*溶解所致;

γ溶血:即不溶血,,菌落周圍的培養(yǎng)基沒(méi)有變化,,紅細(xì)胞沒(méi)有溶解或缺損。

③色素:有些細(xì)菌產(chǎn)生水溶性色素,,使菌落和周圍的培養(yǎng)基出現(xiàn)綠色,、金黃色、白色,、橙色,、檸檬色等顏色,產(chǎn)生的色素有水溶性或脂溶性,。

④氣味:某些細(xì)菌在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖后可產(chǎn)生特殊氣味,,如銅綠假單胞菌(生姜?dú)馕叮⒆冃螚U菌(巧克力燒焦的臭味),、厭氧梭菌(惡臭味),、白色假絲酵母菌(酵母味)和放線菌(泥土味)等。

       2.液體培養(yǎng)基細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中有3種生長(zhǎng)現(xiàn)象:大多數(shù)細(xì)菌在液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)繁殖后呈均勻混濁,;少數(shù)鏈狀排列的細(xì)菌如鏈球菌,、炭疽芽胞桿菌等則呈沉淀生長(zhǎng);枯草芽胞桿菌,、結(jié)核分枝桿菌和銅綠假單胞菌等專性需氧菌一般呈表面生長(zhǎng),,常形成菌膜。

       3.半固體培養(yǎng)基

半固體培養(yǎng)基主要用于細(xì)菌動(dòng)力試驗(yàn),,有鞭毛的細(xì)菌除了沿穿刺線生長(zhǎng)外,,在穿刺線兩側(cè)也可見羽毛狀或云霧狀混濁生長(zhǎng)。無(wú)鞭毛的細(xì)菌只能沿穿刺線呈明顯的線狀生長(zhǎng),穿刺線兩邊的培養(yǎng)基仍然澄清透明,,為動(dòng)力試驗(yàn)陰性,。

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